Identifizierung von EcoHIV-infizierten Zellen in Mikroglia-manipulierten transgenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kombination einer EcoHIV-Infektion mit Tmem119-EGFP-Mäusen ein wertvolles biologisches System für die Untersuchung von Mikrogliaveränderungen und viralen Reservoirs in Nagetiermodellen für HIV-assoziierte neurokognitive Störungen darstellt. Die kombinierte antiretrovirale Therapie hat die Lebensqualität von Menschen, die mit HIV leben, dramatisch verbessert. Um zu verstehen, wie sich HIV auf das zentrale Nervensystem auswirkt, ist ein zuverlässiges und praktikables Modell von HIV erforderlich.

Zuvor wurde ein neuartiges biologisches System unter Verwendung von chimärem HIV, EcoHIV in der Kolation, im Rattenmodell entwickelt, um neurokognitive Beeinträchtigungen und synaptische Dysfunktion zu untersuchen. Eine große Herausforderung besteht nach wie vor bei der Aufklärung der neuroanatomischen Verteilung von EcoHIV, insbesondere seiner unterschiedlichen Expression in verschiedenen Zelltypen im Gehirn. In der aktuellen Studie wurde EcoHIV mit mScarlet-Fluoreszenzmarkierung modifiziert und retroorbital in Tmem119-EGFP-Knock-in-Mäuse injiziert, um festzustellen, ob Mikroglia der Hauptzelltyp sind, der für die Virusexpression verantwortlich ist, und das Reservoir von HIV im Gehirn.

Übertragen Sie zunächst die dissoziierten fötalen Gehirnzellen der Ratte auf eine mit Poly-L-Lysin vorbeschichtete 12-Well-Platte mit Glaseinsätzen, die einen Milliliter DMEM-F12 plus 10 % FBS enthält. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch ein neurobasales Medium, das mit B27 ergänzt ist, und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei Wochen.

Geben Sie dann 60 Mikroliter EcoHIV-mScarlet in die Zellkultur des Gehirns und inkubieren Sie sechs Tage lang. Fixieren Sie die Zellen nach der Inkubation mit 4% Paraformaldehyd. Führen Sie Immunfärbungen an infizierten Gehirnzellen mit spezifischen Primärantikörpern durch und bilden Sie sie an einem konfokalen Mikroskop unter einem 40-fachen Objektiv ab.

Mikroglia wurden als der wichtigste infizierte Zelltyp in Zellkulturen des Gehirns von Ratten identifiziert, wie die Kolokalisation von mScarlet mit CD11b/c- und Iba1-Markern zeigt. Öffnen Sie zunächst die Kopfhaut einer enthaupteten erwachsenen Maus und übertragen Sie das Hirngewebe in eine andere Petrischale, die fünf Milliliter sterilisiertes HBSS enthält. Ziehen Sie die Hirnhäute ab und übertragen Sie den frontalen Kortex in zwei Milliliter HBSS.

Geben Sie anschließend 20 Mikroliter 0,25% Trypsin-EDTA in die Mischung. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und das Röhrchen alle paar Minuten schwenken. Die dissoziierten Zellen werden in einen mit Poly-L-Lysin vorbeschichteten 75-Quadratzentimeter-Kolben überführt, der 10 Milliliter DMEM-F12-Medium und 10 % FBS enthält.

Kultivieren Sie Zellen in einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator, bis sie eine Konfluenz von 90 % erreichen. Als nächstes verdauen Sie die Gehirnzellen mit zwei Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA. Subkultivieren Sie die verdauten Gehirnzellen in eine 35-Millimeter-Glasbodenschale mit fünf Millilitern DMEM-F12-Wachstumsmedium, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen.

Geben Sie dann acht Mikroliter EcoHIV-mScarlet in die Gliazellen der Maus und inkubieren Sie sie zwei Tage lang. Adulte primäre Gliazellen der Maus wurden nach zweitägiger Behandlung erfolgreich mit EcoHIV-mScarlet infiziert. Befestigen Sie zunächst die anästhesierte Tmem119-EGFP-Maus in einer seitlichen Position.

Tauen Sie das EcoHIV-mScarlet auf Eis auf. Füllen Sie die Viruslösung in eine intraokulare Injektorspritze mit einer stumpfen 33-Gauge-Nadel. Platzieren Sie die Maus in der rechten Seitenlage mit dem Kopf nach links.

Identifizieren Sie den Injektionsbereich um die Augenregion. Führen Sie die Nadel langsam und vorsichtig in den medialen Canthus des Auges ein. Schieben Sie dann die Nadel in die Gefäße hinter dem Augapfel vor.

Injizieren Sie 6,5 Mikroliter EcoHIV-mScarlet in den retroorbitalen Sinus. Entfernen Sie nach der Injektion vorsichtig die Nadel. Platzieren Sie die betäubte Maus in Rückenlage in einem chemischen Abzug.

Öffnen Sie die Haut entlang der thorakalen Mittellinie. Trennen Sie dann das Zwerchfell und öffnen Sie den Brustkorb mit einer Schere. Führen Sie nun eine 22-Gauge-Nadel eineinhalb in die linke Herzkammer ein.

Öffnen Sie das rechte Atrium mit einer Schere. Perfundierten Sie den rechten Vorhof mit 50 Millilitern vorgekühltem PBS mit 100 Millimolar und dann mit 100 Millilitern vorgekühltem 4%-Paraformaldehyd. Entfernen Sie das gesamte Gehirn der Maus.

Nachdem Sie das Gehirn in 4% Paraformaldehyd fixiert haben, befestigen Sie das Gehirngewebe mit Gewebekleber auf der Metallplattform des Vibratoms. Schneiden Sie 50 Mikrometer dicke koronale Abschnitte mit Klingen aus Kohlenstoffstahl. Legen Sie anschließend die Gehirnscheiben mit einem Pinsel auf Objektträger.

Geben Sie sofort 0,1 Milliliter Anti-Fade-Eindeckmittel in jeden Abschnitt. Legen Sie einen 22 x 50 Millimeter großen Deckzettel über die Hirnabschnitte und trocknen Sie die Superfrost-Objektträger einen Tag lang im Dunkeln. Verwenden Sie am nächsten Tag ein konfokales Mikroskop mit 488 Nanometern und 594 Nanometern Wellenlänge, um Mehrkanalbilder der interessierenden Gehirnregion aufzunehmen.

EcoHIV-mScarlet-Signale wurden hauptsächlich in Mikrogliazellen beobachtet, die mit EGFP im Gehirn von Tmem119-EGFP markiert waren. In kultivierten Ratten-Gehirnzellen, die mit EcoHIV-mScarlet behandelt wurden, wurde keine signifikante neuronale Infektion festgestellt.