Name: Identifizierung von EcoHIV-infizierten Zellen in Mikroglia-manipulierten transgenen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung von EcoHIV-infizierten Zellen in Mikroglia-manipulierten transgenen Mäusen. Diese Methode nutzt konfokale Mikroskopie zur Untersuchung viraler Reservoirs im ZNS.

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<meta charset="utf8"></head><body>EcoHIV-Infektion bei Tmem119-EGFP-Mäusen zur Untersuchung von Mikrogliaveränderungen

<ol><li>Vigorito, M., Lashomb, A. L., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+and+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial learning and memory in HIV-1 transgenic rats.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 2, 319-328 (2007).</li>
<li>Moran, L. M., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+time+again%3A+Temporal+processing+demands+implicate+perceptual+and+gating+deficits+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Time and time again: Temporal processing demands implicate perceptual and gating deficits in the HIV-1 transgenic rat.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 8 (4), 988-997 (2013).</li>
<li>Repunte-Canonigo,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+consistent+with+neuroAIDS+and+impaired+working+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes consistent with neuroAIDS and impaired working memory in HIV-1 transgenic rats.</a> Mol Neurodegener. 9, 26(2014).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (16), 9271-9276 (2001).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+timing%3A+NeuroHIV+progression+in+the+post-cART+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of timing: NeuroHIV progression in the post-cART era.</a> Sci Rep. 9, 827(2019).</li>
<li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+Synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: Synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeuroVirol%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> J NeuroVirol. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+as+a+model+for+HIV-1+infected+individuals+on+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat as a model for HIV-1 infected individuals on HAART.</a> J Neuroimmunol. 218 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+rats+display+alterations+in+immunophenotype+and+cellular+responses+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic rats display alterations in immunophenotype and cellular responses associated with aging.</a> PLoS ONE. 9, e105256(2014).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Illenberger, J. M., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+HIV-1+expression%3A+Role+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Microglial HIV-1 expression: Role in HIV-1 associated neurocognitive disorders.</a> Viruses. 13 (5), 924(2021).</li>
<li>Kaiser, T., Feng, G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 transgenic mice for labeling and manipulating microglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaiser%2C+T+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (4), (2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Satoh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM119+marks+a+subset+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">TMEM119 marks a subset of microglia in the human brain.</a> Neuropathology. 36 (1), 39-49 (2016).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> J Vis Exp. (108), e53697(2016).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+EcoHIV+brain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat model of EcoHIV brain infection.</a> J Vis Exp. (167), e62137(2021).</li>
<li>Alfar, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+optimizing+production+and+quality+control+of+infective+EcoHIV+virions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for optimizing production and quality control of infective EcoHIV virions.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102368(2023).</li>
<li>Malatesta, P., Hartfuss, E., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+radial+glial+cells+by+fluorescent-activated+cell+sorting+reveals+a+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage.</a> Development. 127 (24), 5253-5263 (2000).</li>
<li>Parpura, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-mediated+astrocyte-neuron+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling.</a> Nature. 369 (6483), 744-747 (1994).</li>
<li>Wahl, A., Al-Harthi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+non-classical+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV infection of non-classical cells in the brain.</a> Retrovirology. 20 (1), 1(2023).</li>
<li>Pandey, H. S., Seth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+turn+foe-astrocytes+contribute+to+neuronal+damage+in+NeuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Friends turn foe-astrocytes contribute to neuronal damage in NeuroAIDS.</a> J. Mol. Neurosci. 69 (2), 286-297 (2019).</li>
<li>Minagar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophage%2Fmicroglia+and+astrocytes+in+the+pathogenesis+of+three+neurologic+disorders%3A+HIV-associated+dementia%2C+Alzheimer%27s+disease%2C+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 202 (1-2), 13-23 (2002).</li>
<li>Borrajo, A., Spuch, C., Penedo, M. A., Olivares, J. M., Agís-Balboa, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+role+of+microglia+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders+and+the+molecular+pathways+implicated+in+its+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Important role of microglia in HIV-1 associated neurocognitive disorders and the molecular pathways implicated in its pathogenesis.</a> Ann Med. 53 (1), 43-69 (2021).</li>
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<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+proliferation+underlies+synaptic+dysfunction+in+the+prefrontal+cortex%3A+Implications+for+the+pathogenesis+of+HIV-1-associated+neurocognitive+and+affective+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Microglia proliferation underlies synaptic dysfunction in the prefrontal cortex: Implications for the pathogenesis of HIV-1-associated neurocognitive and affective alterations.</a> J. Neurovirol. 29 (4), 460-471 (2023).</li>
<li>Kim, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+primary+murine+brain+cell+cultures+to+model+HIV+replication+and+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of primary murine brain cell cultures to model HIV replication and neuropathogenesis.</a> Viruses. 16 (5), 693(2024).</li>
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<li>Jones, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+glial+cell+modulators+in+the+management+of+substance+use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Potential of glial cell modulators in the management of substance use disorders.</a> CNS Drugs. 34 (7), 697-722 (2020).</li>
<li>Kaalund, S. S., Johansen, A., Fabricius, K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untreated+patients+dying+with+aids+have+loss+of+neocortical+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Untreated patients dying with aids have loss of neocortical neurons and glial cells.</a> Front Neurosci. 13, 1398(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>293FT Zellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>33 G, RN-Nadel mit kleiner Nabe, (Spitzenform: 3, Nadellänge: 19,25 mm)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotische Lösung</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100x</td></tr><tr><td>C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J</td><td>Der Jackson Laborstamm</td><td>#:031823</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Gelatine 75cm&sup2; Rechteckige Zellkulturflasche mit schrägem Hals und belüfteter Kappe</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/L Glukose und Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Snap-Cap Mikrozentrifuge Biopur Safe-Lock Röhrchen</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Feather Double Edge Klingen aus Kohlenstoffstahl</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagenzien&nbsp; Mikrobiologie Medien: LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Humaner rekombinanter Anti-CD11b-Antikörper</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-214</td><td>1:50 Verdünnung</td></tr><tr><td>Intraokular Injektorspritze (6,5 &; Mikro; L), Abnehmbare Nadel</td><td>Hamilton</td><td>6609071-01</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; One Shot TOP10 Electrocomp&nbsp;E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404052</td><td></td></tr><tr><td>Irispinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus-assoziiertes p24 ELISA Kit</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Konzentrator</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiSlicer&nbsp; Vibrations-Tissue-Schneidemaschine</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>11000</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Pro CA44 Gewebekleber</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>10033</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Pro Specimen Retriever</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>101-33</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen monoklonaler Anti-Iba1-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab178847</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>RN Kompressionsverschraubung 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sevofluran</td><td>Merritt Veterinärversorgung</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley trächtige Ratte</td><td>Inotiv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Folien</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>To-Pro-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Zellkern-Färbekit</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von ecohiv-infizierten zellen in mikroglia-manipulierten transgenen mäusen

Identification of EcoHIV-Infected Cells in Microglia-Manipulated Transgenic Mice

Ein Fragment von mScarlet (1858 bp), das Enzymstellen von "Cla1" am 3'-Ende und "Not1" am 5'-Ende enthielt, wurde in den pNL4-3-EcoHIV-lentiviralen Vektor eingefügt (Abbildung 1). Um die Expression von EcoHIV-mScarlet zu validieren, wurden primäre Hirnzellen, die aus der Hirnrinde von Rattenembryonen isoliert wurden, 6 Tage lang in vitro mit EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/ml) behandelt. Die Daten in Abbildung 2 zeigten, dass rot fluoreszierende Signale von mScarlet hauptsächlich in glialen Zelltypen lokalisiert waren, basierend auf der unterschiedlichen Zellmorphologie. Darüber hinaus zeigte die Markierung von CD11b/c und Iba1 (Zellmarker für Mikroglia), dass mScarlet-Signale mit CD11b/c + und/oder Iba1 + Zellen kolokalisiert waren. Die Daten deuteten darauf hin, dass Mikroglia in vitro der Hauptzelltyp der EcoHIV-mScarlet-Verteilung waren. Es gab keine signifikante neuronale Infektion in den kultivierten Zellen (Ergänzende Abbildung 1). 
Als nächstes wurde die Infektion von EcoHIV-mScarlet an adulten primären gemischten Gliazellen der Maus getestet. Zu diesem Zweck wurden zunächst gemischte Gliazellen von adulten Mäusen isoliert und gereinigt (2 Monate) und 2 Tage lang mit EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/ml) infiziert. Die Bilder in Abbildung 3 zeigten, dass EcoHIV-mScarlet erfolgreich die Gliazellen adulter Mäuse infizierte.
Um das Verteilungsmuster von EcoHIV-mScarlet im Gehirn von Mäusen weiter zu untersuchen, insbesondere zur Identifizierung des infizierten Zelltyps, wurde EcoHIV-mScarlet retroorbital in eine Tmem119-EGFP-Knock-in-Mauslinie injiziert, in der Mikroglia spezifisch mit EGFP-Signalen markiert wurden, ohne dass andere Makrophagentypen von Konfliktenauftraten 5. Die Ergebnisse in Abbildung 4 (auch in der ergänzenden Abbildung 2) zeigen, dass mScarlet-rote Fluoreszenzsignale in EGFP-positiven Zellen beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass Mikroglia der Hauptzelltyp der EcoHIV-Expression in Mäusegehirnen ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Die Vektorkarte von EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Die EcoHIV-mScarlet-Infektion in primären Gehirnzellen von Ratten. (A,E) Repräsentative Bilder der CD11b/c-Färbung an primären Gehirnzellen. Die Gehirnzellen wurden aus E18-Rattenembryonen isoliert und 6 Tage lang mit dem EcoHIV-mScarlet-Virus infiziert. (B,F) Repräsentative Bilder von mScarlet-Fluoreszenzsignalen von in vitro Gehirnzellen. (C,G) Repräsentative Bilder der Iba1-Färbung an primären Gehirnzellen. (D,H) Zusammengeführte Bilder der dreifachen Markierung von CD11b/c, mScarlet und Iba1. Maßstabsstäbe: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig03.jpg"> 
Abbildung 3: EcoHIV-mScarlet-Infektion in primären gemischten Gliazellen der Maus. (A,B) Repräsentative konfokale Bilder der mScarlet-Verteilung in vitro. Die primären gemischten Gliazellen wurden von adulten C57BL6-Mäusen (2 Monate alt) isoliert und vor der Virusinfektion 2 Wochen lang kultiviert. Das EcoHIV-mScarlet wurde für zwei Tage in das Kulturmedium gegeben und die Bilder unter dem 60×-Objektiv des konfokalen Mikroskops aufgenommen. Maßstab: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig04.jpg"> 
Abbildung 4: EcoHIV-mScarlet-Verteilung in der Knock-in-Mauslinie von Tmem119-EGFP . (A,B) Zusammengeführte Bilder von mScarlet/EGFP/ToPro3-Signalen in Gehirnschnitten. Der gelbe Rahmen zeigt den Zielbereich von (B) an. Maßstabsbalken: 300 μm. (C) Repräsentatives Bild der mScarlet-Verteilung in der äußeren plexiformen Schicht der olfaktorischen Region der Knock-in-Mauslinie Tmem119-EGFP . (D) Repräsentatives Bild der EGFP-Verteilung. Die Fluoreszenzsignale wurden in Mikrogliazellen in der Tmem119-EGFP-Knock-in-Mauslinie lokalisiert. (E) Repräsentatives Bild der TO-PRO-3-Kernfärbung. Maßstabsbalken: 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: MAP2- und MOG-Färbung von primären Gehirnzellen der Ratte, die mit dem EcoHIV-mScarlet-Virus infiziert sind. Maßstabsbalken: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Konfokale Bilder der EcoHIV-mScarlet-Infektion in der Knock-in-Mauslinie von Tmem119-EGFP . Maßstabsstäbe: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: DNA-Sequenz des EcoHIV-mScarlet-Plasmids. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20data%20-%20EcoHIV-mScarlet%20plasmid%20DNA%20sequence.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Identifizierung von EcoHIV-infizierten Zellen in Mikroglia-manipulierten transgenen Mäusen

Combined antiretroviral therapy (cART) has dramatically improved the quality of life for people living with HIV (PLWH). However, over 4 million PLWH are ...

identification-ecohiv-infected-cells-microglia-manipulated-transgenic

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikroglia (iPSMG) in das Gehirn über einen transnasalen Weg bei immunkompetenten Mäusen. Die Methode zur Herstellung und transnasalen Transplantation von Zellen und die Verabreichung von Zytokinmischung zur Aufrechterhaltung von iPSMG wird gezeigt.

Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia im immunkompetenten Mäusegehirn über nicht-invasiven transnasalen Weg

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung globaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Hirnmikroglia. Die Arbeit enthält auch das Mikroglia-Isolationsprotokoll, das für die Datenerhebung verwendet wurde.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung  

Diese Arbeit demonstriert eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikroglia-Motilität und des Kontakts mit postsynaptischen Puncta in der Netzhaut mittels rotierender Scheiben-Konfokalmikroskopie.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik und Wechselwirkungen mit Synapsen in erkrankter Maus-Netzhaut

Dieses Protokoll kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um Mikrogliazellzustände im Kleinhirn von frühen postnatalen Mäusegehirnen zu isolieren und zu charakterisieren. Es verwendet enzymatische Dissoziation, Percoll-Zentrifugation und Immunfärbung, um die Heterogenität der Mikroglia aufzudecken und das Verständnis ihrer Rolle bei der Kleinhirnentwicklung und -erkrankung zu verbessern.

Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

Erfahren Sie die Identifizierung von EcoHIV-infizierten Zellen in Mikroglia-manipulierten transgenen Mäusen. Diese Methode nutzt konfokale Mikroskopie zur Untersuchung viraler Reservoirs im ZNS.

Identifizierung von EcoHIV-infizierten Zellen in Mikroglia-manipulierten transgenen Mäusen

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