Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

Auf dem Gebiet des Knorpelgewebe-Engineerings und der regenerativen Medizin besteht nach wie vor der Bedarf, die biologischen und funktionellen Ergebnisse im Hinblick auf die Verbesserung der laufenden Behandlung und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu verbessern. Aktuelle präklinische Forschungen deuten auf den potenziellen Einsatz von aus Knorpel gewonnenen Chondroprogenitoren als praktikable Option für die Knorpelheilung hin. Die aktuelle Forschung umfasst Strategien zur weiteren Steigerung des chondrogenen Potenzials bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung einer geringeren hypertrophen Potenz durch den Einsatz zusätzlicher Wachstumsfaktoren und genrekombinanter Techniken.

Chondroprogenitoren stehen vor experimentellen Herausforderungen, darunter ein fehlender Konsens über die Nomenklatur, verschiedene Isolationstechniken, Schwierigkeiten bei der Charakterisierung, Variabilität der Kulturbedingungen und ein begrenztes Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen. Der klinische Nachweis, dass Chondroprogenitoren im Vergleich zu häufig verwendeten Zellen positive Ergebnisse liefern, könnte die globale Belastung im Zusammenhang mit knorpelbedingten Pathologien erheblich reduzieren. Entwicklung verbesserter Therapeutika unter Verwendung zellfreier Alternativen, wie z. B. extrazellulärer Vesikel, die von Vorläuferzellen abgeleitet sind, und unter Verwendung rekombinanter Strategien zur Regeneration von echtem hyalinähnlichem Knorpel.

Gewinnen Sie zunächst tibiofemorale oder Kniegelenke von menschlichen Spendern in 1X PBS unter sterilen Bedingungen und übertragen Sie dann die entnommenen Gelenke auf das sterile Unterpolster in der Haube. Um die Gelenke zu stabilisieren, halten Sie den subchondralen Knochen mit dem Knorpel nach oben. Entnehmen Sie mit einer Skalpellklinge der Nummer 22 rechteckige Knorpelspäne aus den nicht belastenden Bereichen.

Schneiden Sie den Knorpel von der oberflächlichen Schicht bis zur tieferen Schicht in acht Millimeter mal 10 Millimeter große Abschnitte. Nachdem Sie die Scheiben mit PBS gewaschen haben, legen Sie sie in eine Petrischale, die ein bis zwei Milliliter einfaches Dulbecco modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) enthält. Anschließend die Knorpelscheiben mit einer Skalpellklinge der Nummer 22 auf eine Größe von weniger als einem Millimeter zerkleinern.

Gewinnen Sie zunächst gehackten Knorpel aus entnommenen menschlichen Kniegelenken. Den zerkleinerten Knorpel in einen aufrechten T25-Kolben geben, der 10 Milliliter serumfreies DMEM/F-12 mit 0,15 % Kollagenase Typ II für den enzymatischen Aufschluss enthält. Lassen Sie den Kolben 12 bis 14 Stunden lang ungestört in einem Kohlendioxid-Inkubator.

Nach dem Aufschluss über Nacht wird das Medium, das die freigesetzten Chondrozyten enthält, in ein frisches steriles Zentrifugenröhrchen überführt. Verwenden Sie ein Zellsieb, um die Zellen von den Ablagerungen zu trennen. Fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM/F-12 mit 10 % fötalem Rinderserum oder FBS hinzu.

Die gefilterten Zellen werden fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bei 1.200 g zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, rekonstituieren Sie das Pellet in einem Milliliter Medium. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Trypanblau-Ausschlussassay.

Als nächstes werden die Chondrozyten in einer Konzentration von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter in einen T25-Kolben geladen. Erweitern Sie die Zellen mit DMEM/F-12 mit 10 % FBS auf die gewünschte Durchgangsnummer. Frischen Sie das Medium alle drei Tage auf, bevor Sie die Zellen an der Subkonfluenz mit 0,125 % EDTA-haltigem Trypsin ernten.

Chondrozyten hafteten sofort nach dem Laden und gingen bei der Ausdehnung von einer abgerundeten Kopfsteinpflasterform in ein fibroblastisches Aussehen über. Gewinnen Sie zunächst Knorpelspäne aus entnommenen menschlichen Tibiofemoral- oder Kniegelenken. Setzen Sie die Knorpelspäne über Nacht einer sequentiellen enzymatischen Verdauung aus, wobei zunächst drei Stunden lang 0,2 % Pronase verwendet wurden, gefolgt von 0,04 % Kollagenase Typ II für 12 Stunden in einem Schüttelwasserbad, das bei 37 Grad Celsius gehalten wurde.

Beschichten Sie dann die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 1,5 Millilitern der PBS-Fibronektinlösung. Verschließen Sie die Platte fest und kühlen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie am nächsten Tag die mit Fibronektin beschichtete Sechs-Well-Platte aus dem Kühlschrank.

Nachdem Sie überschüssiges Fibronektin entfernt haben, geben Sie zwei bis drei Milliliter reines DMEM/F-12-Medium in die beschichteten Wells. Säen Sie die freigesetzten Chondrozyten mit einer Dichte von 4.000 Zellen pro Well auf die beschichteten Wells und lassen Sie die Platte 20 Minuten lang ungestört. Nach der Inkubation aspirieren Sie das überschüssige Medium und die nicht adhärenten Zellen.

Geben Sie zwei bis drei Milliliter DMEM/F-12 mit 10 % fötalem Rinderserum in die Vertiefungen. Halten Sie die adhärenten Zellen 10 bis 12 Tage lang unter Standardkulturbedingungen, um Klone von chondrogenen Vorläuferzellen oder CPC zu erhalten, isolieren Sie dann die CPC-Klone 180 Sekunden lang mit 0,125 % Trypsin-EDTA und wiederholen Sie sie dann in einem Verhältnis von einem Klon pro fünf Quadratzentimeter. Erweitern Sie die angereicherten polyklonalen CPCs auf die erforderliche Konfluenz.

Chondrozyten, die einem Fibronektin-Adhäsionsassay unterzogen wurden, zeigen ein klonales Wachstum und erreichen bis zum Tag 10 eine Verdopplung der Population um fünf. Zu Beginn werden die rasierten Knorpelexplantate aus dem entnommenen Gelenkgelenk in zugesetztem DMEM/F-12-Medium gewonnen. Legen Sie die Platte mit den Explantaten für 48 Stunden in einen Kohlendioxid-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.

Nach zwei Tagen werden die Explantate in ein Zentrifugenröhrchen mit 10 Millilitern 0,1%iger Kollagenaselösung für den enzymatischen Aufschluss überführt. Inkubieren Sie das Röhrchen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach dem Aufschluss werden die Explantate mit 1X PBS gespült und in die gleichen Vertiefungen in die Platte mit dem frisch ergänzten DMEM/F-12-Medium zurückgeführt.

Halten Sie die Platte unter Standardkulturbedingungen im Inkubator und überwachen Sie die Migration von Chondroprogenitoren in den folgenden Tagen. Sobald die Explantate die Subkonfluenz erreicht haben, ernten Sie die mesenchymalen Chondroprogenitorenzellen oder MCPs mit 0,125%iger Trypsin-EDTA-Lösung. Erweitern Sie die MCPs mit dem ergänzten DMEM/F-12-Medium.

Chondroprogenitoren beginnen am 10. Tag der Kultur vom Rand des Explantats zu wandern und zeigen ein spindelförmiges Wachstumsmuster mit weiterer Ausdehnung.