Name: Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren aus humanem Gelenkknorpel mittels enzymatischer Verdauung und Fibronektin-Adhäsionsassay. Diese Methode unterstützt die Entwicklung regenerativer Therapien.

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<meta charset="utf8"></head><body>Chondroprogenitor und Chondrozytenisolierung aus humanem Gelenkknorpel

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<li>Fernandez-Moure, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+from+cortical+bone%3A+a+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).</li>
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<li>McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+equine+articular+cartilage+progenitor+cells+and+bone+marrow-derived+stromal+cells+as+potential+cell+sources+for+cartilage+repair+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+J%22%5BJournal%5D)">The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse.</a> Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).</li>
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<li>Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+articular+cartilage+derived+chondroprogenitors+for+cartilage+repair+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthopaed%22%5BJournal%5D)">Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models.</a> J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22-Skalpell-Klinge&nbsp;</td><td>GLASS VAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>J6012</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>130223</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B (2 &mu; g/mL).</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure (62 &mu; g/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>BC CytoFLEX LX Durchflusszytometer&nbsp;</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>CYTExpert Software Version 2.5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>&nbsp; C34006</td><td></td></tr><tr><td>CD105-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561443 <tr><td>CD106-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 551147 <tr><td>CD14-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555397 <tr><td>CD29-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 559883 <tr><td>CD34-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>CD45-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td> 347463</tr><tr><td>CD49b-FITC</td><td>MILTENYL BIOTEC</td><td>&nbsp; MACS 130/100337</td><td></td></tr><tr><td>CD49e-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555617 <tr><td>CD73-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr>550257<td>CD90-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>561970</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>DE NOVIX</td><td>Cell Drop BF</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>HIMEDIA</td><td>TCP024</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator&nbsp;</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>MODEL-371</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ X (COL10A1), Runt-verwandter Transkriptionsfaktor (RUNX2), SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) und Kollagen Typ II (COL2A1)</td><td>EUROGENTEC, BELGIEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>WORTHINGTON</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>D8900-1L</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Plate Reader</td><td>MOLECULAR DEVICES</td><td>SpectraMax i3x Reader</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>FISHER SIENTIFIC</td><td>2353459</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>CLOUD CLONE CORP</td><td>APA551Hu01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin (10 & Mikro; L/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Erststrang-Synthesesystem</td><td>TAKARA BIO</td><td>6110A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39411</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>M8787</td><td></td></tr><tr><td>Öl Rot O</td><td>SIGMA</td><td>1320065</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler&nbsp;</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>Quantstudio 12K Flex Thermocycler&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100 IE/ml)</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red</td><td>ALFA AESAR</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Primärantikörper (Maus Kollagen Typ II)</td><td>DSHB</td><td>DSHB II II6B3</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>ROCHE</td><td>10165913103</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Reagenz</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Kühlschrank</td><td>ELANPRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniKit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39962</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper, HRP-Konjugat)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>31430</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad&nbsp;</td><td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemPro Differenzierungskits&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>1007201, A1007001 und A1007101</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Kolben&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blau&nbsp;</td><td>EUROGENTEC</td><td>UF-LSMT-B0701</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>ABCAM</td><td>ab277760</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur Petridish</td><td>TARSONS</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>QUALIGENS</td><td>2040</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan blau</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von chondrozyten und chondroprogenitoren mittels fibronektin-adhäsions- und migrationsassay

Isolation of Chondrocytes and Chondroprogenitors Using Fibronectin Adhesion and Migratory Assay

Von 86,9 mg Knorpelscheiben wurde eine Chondrozytenzellausbeute von 1,72 x 105 Zellen festgestellt. Nach dem Laden haften die Chondrozyten sofort an, zeigen ein anfänglich abgerundetes Kopfsteinpflaster-Aussehen und gehen bei weiterer Expansion in einen fibroblastischen Zustand über (Abbildung 1 A, B). Die Aussaat dieser Chondrozyten auf Fibronektinplatten führt in der Regel zu einer Adhäsion von 2 %, wobei jede Zelle ein klonales Wachstum durchläuft (Abbildung 2 C,D) und eine Populationsverdopplung von 5 bis zum 10. bis 12. Tag (32 Zellen/Klon) erreicht. Die Klone innerhalb des 10 cm² großen Bereichs werden kombiniert und auf den notwendigen Durchgang zur Herstellung von FAA-CPs erweitert. Knorpelexplantate, die nach der Kollagenase-Inkubation in Kultur gehalten werden, zeigen eine Lockerung der extrazellulären Matrix, und die Migration wird im Allgemeinen bereits am 7. Tag beobachtet (Abbildung 2E). Sowohl FAA-CPs als auch MCPs weisen eine spindelförmige Struktur auf, eine Eigenschaft, die häufig mit BM-MSCs in Verbindung gebracht wird und vor dem Zusammenfluss eine wabenartige Struktur annimmt (Abbildung 1E,F).
Die drei Arten von isolierten Zellen, nämlich Chondrozyten, FAA-CPs und MCPs, werden mit Hilfe der Phasenkontrastbildgebung engmaschig überwacht. Die FAA-CPs werden erst nach Bestätigung von fünf Populationsverdopplungen übertragen.
Die phänotypische Charakterisierung der isolierten und expandierten Zellen umfasst typischerweise die durchflusszytometrische Analyse auf mutmaßliche Marker der Chondrogenese, nämlich CD146 und CD166, sowie die Genexpressionsanalyse auf Marker der Chondrogenese (SOX-9, ACAN, COL2A1), den Faserknorpelmarker COL1A1 und Marker der Hypertrophie (RUNX2 und COL10A1). Alle drei Zellgruppen weisen eine hohe Expression (&gt;95%) von CD105, CD73 und CD90 auf; geringe bis negative Expression von CD34 und CD45; und eine hohe Expression (&gt;98%) von CD166 mit moderater, spenderabhängiger Expression von CD146 (40%-75%) (Abbildung 2A).
Die qRT-PCR-Ergebnisse zeigen eine vergleichbare und hohe Expression von SOX-9, ACAN und auch COL1A1, einem Faserknorpelmarker, da die Zellen vor der Auswertung kultiviert werden (Abbildung 2B). Zur Bestätigung der Chondrogenese wird in allen Zellgruppen eine positive Aufnahme von orange-roten Komplexen in den GAG-haltigen Bereichen nach Safranin O und bläulichen bis violetten Komplexen nach Alcianblau und Toluidinblau beobachtet, mit einem höheren Anteil in den FAA-CP- und MCP-Gruppen. Die immunhistochemische Analyse der chondrogen-differenzierten Pellets für Kollagen Typ II zeigt in allen drei Gruppen eine bräunliche Fibrillenaufnahme (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigte die GAG/DNA-Analyse auch eine Bestätigung der chondrogenen Differenzierung mit FAA-CP-Gruppen, die eine höhere Expression zeigten (Abbildung 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Isolierung und Charakterisierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren. Der Studienalgorithmus bildet die Isolierung von drei Zellgruppen und ihre morphologischen Merkmale unter einem Phasenkontrastmikroskop unmittelbar nach der Isolierung und nach einigen Tagen der Expansion ab. (A) Frisch isolierte Chondrozyten heften sich in den frühen Tagen der Kultur an adhärente Kulturen und erhalten mit weiterer Expansion ein fibroblastisches Aussehen (B). (C) Chondrozyten, die einem Fibronektin-Adhäsionsassay unterzogen wurden, zeigen ein klonales Wachstum und erreichen eine Populationsverdopplung von 5 bis zum Tag 10 (D). (E) Chondroprogenitoren wandern am 10. Tag der Kultur vom Rand des Explantats und zeigen ein spindelförmiges Wachstumsmuster mit weiterer Expansion (F). Phasenkontrast-Bildvergrößerung: 10x; Maßstabsbalken: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Molekulare Charakterisierungsdaten. (A) Durchflusszytometrische Analyse auf positive und negative MSC-Marker und potentielle Chondrogenese-Marker. (B) RT-PCR-Expressionsdaten für die drei Zellgruppen für die Genexpressionsanalyse von chondrogenen und hypertrophen Markern. (C) Gesamt-GAG/DNA-Analyse der chondrogenen differenzierten Pellets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Konfirmatorische Färbung nach chondrogener Differenzierung. Safranin O und immunhistochemische Analyse auf Kollagen Typ II zwischen den drei Zellgruppen. Maßstabsleisten: für 10-fache Vergrößerung, 50 μm; 40-fache Vergrößerung, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

Chondroprogenitor cells (CPCs), recently identified as a distinct subpopulation, exhibit promise due to their mesenchymal properties, heightened ...

isolation-chondrocytes-chondroprogenitors-using-fibronectin-adhesion

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Eine Methode, um Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale Arginin Glycin Asparagin (RGD) Oberfläche Säuredichte ermöglichen ist beschrieben und für das Studium der Zelldifferenzierung Adhäsion und Chondrogenic angewendet.

Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Infrapatellare Fettpolster mesenchymale Stammzellen (IFP-MSCs) können leicht aus dem infrapatellaren Fettpolster des Kniegelenks isoliert werden. Sie vermehren sich gut in vitro, bilden CFU-F-Kolonien und differenzieren sich in adipogene, chondrogene und osteogene Linien. Hierin wird die Methodik für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von IFP-MSCs aus dem Ziegenstielgelenk bereitgestellt.

Isolierung, Expansion und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem infrapatellaren Fettpolster des Ziegenwürgegelenks

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Wir beschreiben eine qualitative Tests für Hefe Haftung und Agar-Invasion als Maß für die invasive und pseudohyphal Differenzierung. Dieser einfache Test kann verwendet werden, um den invasiven Phänotyp der verschiedenen Mutanten sowie die Auswirkungen Umweltreize zu bewerten und Signalwege auf Hefe Differenzierung.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

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Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Erfahren Sie die Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren aus humanem Gelenkknorpel mittels enzymatischer Verdauung und Fibronektin-Adhäsionsassay. Diese Methode unterstützt die Entwicklung regenerativer Therapien.

Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

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