Name: Kovalentes Fragment-Screening mit dem quantitativen irreversiblen Tethering-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Erfahren Sie das quantitative irreversible Tethering (qIT) für die kovalente Fragment-Screening. Diese fluoreszenzbasierte Methode identifiziert selektive kovalente Liganden für Arzneimittelziele ohne Massenspektrometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Aufbau einer Fragmentbibliothek
<ol>
	<li>Entwerfen Sie eine Bibliothek mit elektrophilen Fragmenten und synthetisieren Sie sie oder kaufen Sie sie. Elektrophile Fragmentbibliotheken bestehen typischerweise aus leicht reaktiven Elektrophilen (wie Acrylamiden, Chloracetamiden und Vinylsulfonamiden), die an eine Vielzahl von chemischen Gerüsten angehängt sind. Elektrophile Fragmentbibliotheken sind bei kommerziellen Anbietern weit verbreitet, und weitere Einzelheiten zu ihrem Design und ihrer Konstruktion werden an anderer Stelle besprochen 5,11.</li>
	<li>Löse jede Verbindung in DMSO bis zu einer Konzentration von 50 mM auf und dosiere dann eine andere Verbindung in jede Vertiefung der Säulen 3 bis 22 einer 384-Well-Reservoirplatte, die als Fragment Library Plate bezeichnet wird.<ol>
		<li>Dispensieren Sie DMSO in jede Vertiefung der Spalten 1, 2, 23 und 24 für die Positiv- und Negativkontrollen. Das Plattenlayout kann je nach Anzahl der zu siebenden Verbindungen variiert werden (Abbildung 2). Das Volumen, das der Bibliotheksplatte hinzugefügt wird, hängt von der Anzahl der durchzuführenden Screens ab, wobei ca. 1,8 μl aus jedem Well pro qIT-Sieb erforderlich sind. Bereiten Sie diese Fragment Library Plate im Voraus vor und lagern Sie sie bei 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Plattenlayout. Ein Überblick über das Layout der 384-Well-Platten des qIT-Assays. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Aufbau des Assays (Abbildung 3)
<ol>
	<li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: rekombinante Proteinlösung (Zielprotein in einem beliebigen Puffer), qIT-Assay-Puffer (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), qIT-Assay-Quench-Puffer (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7,5)) und zusammengesetzte Stammlösungen (elektrophiles Fragment (50 mM) in DMSO). HINWEIS: Im Reaktionspuffer wird ein pH-Wert von 8 verwendet, um die Reaktion zwischen dem Ziel-Cysteinrest und den Fragmenten zu beschleunigen, so dass die Reaktionsgeschwindigkeit auch bei extrem schwach reaktiven Fragmenten gemessen werden kann. Ein etwas niedrigerer pH-Wert von 7,5 wird im Quench-Puffer verwendet, da die Thioetherbindung, die zwischen dem Maleimid von CPM und dem Cysteinthiol gebildet wird, bei basischeren pH-Werten zur Hydrolyse neigt (z. B. fanden frühere Arbeiten heraus, dass Cystein-Maleimid-Konjugate bei pH 7,3 weitaus stabiler sind als bei pH 812).</li>
	<li>Nehmen Sie die DMSO-Fragment-Stammlösungen aus dem Lager und lassen Sie sie mindestens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur, damit die zusammengesetzten Bestände auftauen können.</li>
	<li>Entgasen Sie den qIT-Assay-Puffer durch Blasen mit Argongas für ca. 30 Minuten.</li>
	<li>Tauschen Sie die Zielproteinlösung gründlich in entgasten qIT-Assay-Puffer aus. Entscheidend ist, dass Reduktionsmittel wie DTT und TCEP bis zu Konzentrationen &lt; 100 nM gründlich entfernt werden, da sie die Thiolquantifizierung beeinträchtigen. Dieser Schritt kann über eine sich wiederholende Reihe von Puffertauschen durchgeführt werden, wie unten beschrieben.<ol>
		<li>Die Proteinlösung, die den entgasten qIT-Assay-Puffer übersteigt, in einer Spin-Filtereinheit verdünnen, durch Zentrifugation (4000 x g, 4 °C, 15 min) konzentrieren und den Vorgang wiederholen. Typischerweise sind 4 Runden von 1 zu 15 Verdünnungen erforderlich, um DTT (1 mM) ausreichend aus 1 ml rekombinanter Proteinstammlösung zu entfernen, obwohl dieser Schritt in Abhängigkeit von der Reduktionsmittelkonzentration in der ursprünglichen rekombinanten Proteinlösung angepasst werden kann. HINWEIS: Alternativ kann die Dialysierung der Zielproteinlösung gegen einen großen Überschuss an entgastem qIT-Assay-Puffer das gleiche Ergebnis erzielen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Die Zielproteinlösung (hergestellt in Schritt 2.1) wird in entgastem qIT-Assay-Puffer auf eine Proteinkonzentration von 15 μM verdünnt. Ungefähr 9 ml Zielproteinlösung sind erforderlich, um eine 384-Well-Platte mit ausreichendem Totvolumen zu füllen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1,5%ige (v/v) Suspension von TCEP-Agarose in entgastem qIT-Assay-Puffer vor. Pro Siebplatte sind ca. 9 ml TCEP-Agarose-Suspension erforderlich.</li>
	<li>Dispensieren Sie 20 μl TCEP-Agaroselösung in jede Vertiefung von zwei 384-Well-Platten.</li>
	<li>Bereiten Sie einen 15 μM Glutathion-Stamm in entgastem qIT-Assay-Puffer vor. Dies sollte unmittelbar vor dem Plattieren zubereitet werden, da Glutathion in Lösung ohne Reduktionsmittel schnell oxidiert.</li>
	<li>Geben Sie 20 μl qIT-Assay-Puffer in die Spalten 1 und 2 der beiden 384-Well-Platten.</li>
	<li>Geben Sie 20 μl 15 μM Protein- oder Glutathionlösung (entsprechend der vorgesehenen Platte) in die Spalten 3-24 der 384-Well-Platte. Diese werden als Protein-Reaktionsplatte und Glutathion-Reaktionsplatte bezeichnet. Bei RT 1 h einkochen lassen.</li>
	<li>Geben Sie 58,2 μl entgasten qIT-Assay-Puffer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte und übertragen Sie dann 1,8 μl aus jeder entsprechenden Vertiefung der Fragmentbibliotheksplatte, um eine Verbindungsverdünnungsplatte zu erstellen, in der jede Verbindung auf eine Konzentration von 1,5 mM in qIT-Assay-Puffer plus 3 % DMSO verdünnt wird. HINWEIS: Dieser Schritt wird durch eine Pipettierstation mit 384 erleichtert, mit der Mischbestände für jede Vertiefung in einem Arbeitsgang übertragen werden können.</li>
	<li>Nach einer 1-stündigen Inkubation von Protein und Glutathion mit TCEP-Agarose werden 20 μl Verbindungslösung aus jeder Vertiefung der Verbindungsverdünnungsplatte in die Protein- und Glutathion-Reaktionsplatten überführt, um den Assay zu starten. Auch dieser Schritt wird durch eine Pipettierstation 384 erleichtert. Die Untersuchungsschritte sind in Abbildung 3 zusammengefasst. HINWEIS: Die Fragmentkonzentration kann nach Bedarf variiert werden, und qIT-Assays können für die Treffer bei niedrigeren Konzentrationen wiederholt werden, falls gewünscht, um zu bestätigen, dass die Proteinaffinität kein Artefakt der hohen Fragmentkonzentration ist. Die relativ hohe Fragmentkonzentration wird verwendet, um den kpro und kGSH zu erhöhen, um sicherzustellen, dass genaue Raten für leicht reaktive Verbindungen (die unter den Assay-Bedingungen t1/2(GSH) &gt; 24 h anzeigen können) bestimmbar sind. Obwohl eine Fragmentkonzentration von 500 μM hoch ist, wurden beim Fragmentscreening beispielsweise hohe bis niedrige μM-Konzentrationen verwendet, z. B.13.</li>
	<li>Starten Sie einen Timer - der Assay hat begonnen, und die Quenches sollten zu regelmäßigen Zeitpunkten gemäß dem folgenden Abschnitt durchgeführt werden.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
Abbildung 3: Zusammenfassung des qIT-Assays. Eine Zusammenfassung, die die wichtigsten Schritte der Einrichtung der qIT-Assay-Reaktions-Wells veranschaulicht. (erstellt mit BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
3. CPM-Quenches
HINWEIS: CPM-Quenches werden durchgeführt, um die Menge an nicht umgesetztem Thiol zu quantifizieren, die in den Protein- und Glutathion-Reaktionsplatten verbleibt. Diese sollten zu diskreten Zeitpunkten durchgeführt werden (z. B. werden typischerweise die folgenden Zeitpunkte verwendet: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 und 1440 min), um die Überwachung der Reaktionskinetik zu ermöglichen.
<ol>
	<li>Bereiten Sie CPM-Stammlösungen (500 μM) in DMSO vor, geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen in 111,2 μl Aliquots ab und lagern Sie sie bei -20 °C. Diese CPM-Bestände können im Voraus vorbereitet werden, und es ist 1 Aliquot pro Quench-Zeitpunkt erforderlich.</li>
	<li>Bereiten Sie CPM-Quenchlösung (1,4 μM) vor, indem Sie eine gefrorene CPM-Stammlösung (500 μM) auftauen und sie zu einem 40 mL qIT-Assay-Quenchpuffer hinzufügen.</li>
	<li>Dispensieren Sie 27 μl CPM-Quenchlösung in jede Vertiefung von zwei 384-Well-Platten – zwei sind zum Quenchen sowohl der Protein- als auch der Glutathion-Reaktionsplatten erforderlich. Diese werden als CPM-Quench Plates bezeichnet, bereiten Sie diese maximal 30 min vor Gebrauch vor.</li>
	<li>Die Proteinreaktionsplatte wird 3 min lang bei 200 x g zentrifugiert, um sicherzustellen, dass TCEP-Agarose pelletiert wird.</li>
	<li>Übertragen Sie zu festgelegten Zeitpunkten eine 3 μl Probe aus jeder Vertiefung der Proteinreaktionsplatte auf eine vorgefüllte CPM-Quenchplatte. Auch dieser Schritt wird mit einer Pipettierstation 384 vereinfacht.</li>
	<li>Mischen Sie die CPM Quench Plate, indem Sie 3 x 25 μl aspirieren und dosieren. Es ist wichtig, die Probe von der Oberseite der Vertiefung zu entfernen, um zu vermeiden, dass die TCEP-Agarose am Boden aspiriert wird, da dies die CPM-Quenchung beeinträchtigen würde.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.6 mit der Glutathion-Reaktionsplatte.</li>
	<li>Die CPM-Quenchplatten (vorbereitet in 3.4-3.6) 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenzintensität der CPM-Quenchplatte (Anregung bei 384 nm und Emission bei 470 nm).</li>
</ol>
4. Datenanalyse und Trefferauswahl
<ol>
	<li>Berechnen Sie für jede Quench Z' als Maß für die Qualität des Assays. CPM-Quenches mit Z' &lt; 0,5 sollten nicht berücksichtigt werden. Z' = 1 - ((3σPositivkontrolle + 3σNegativkontrolle) / (μPositivkontrolle - μNegativkontrolle)) Dabei σ = Standardabweichung der Fluoreszenzintensität und μ = Mittelwert der Fluoreszenzintensität</li>
	<li>Berechnen Sie die mittleren Fluoreszenzwerte für die negativen und positiven Kontrollvertiefungen (Spalten 1 und 2 bzw. 23 bzw. 24).</li>
	<li>Normalisieren Sie jede Reaktion gut auf die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte der Positiv- und Negativkontrolle: % modifiziert = 100 x (Compound-Well-Fluoreszenz - Negativkontrollfluoreszenz) / (Positivkontrollfluoreszenz - Negativkontrollfluoreszenz)</li>
	<li>Separat ist der über die Zeit modifizierte Prozentsatz für jede Verbindung, die mit Glutathion und mit dem Zielprotein reagiert, darzustellen.</li>
	<li>Passen Sie die normalisierten prozentual modifizierten Daten über die Zeit an ein einphasiges exponentielles Zerfallsmodell sowohl für die Reaktion mit Protein als auch mit Glutathion an, indem Sie die folgende Gleichung verwenden: % Modifiziert = ae - kt + c Dabei ist a = der Bereich der in % geänderten Werte, k = Reaktionsgeschwindigkeit, t = Zeit, c = der in % geänderte Wert in unendlicher Zeit. Die Kurvenanpassung und Parameterbestimmung kann mit kommerzieller Software (z. B. Graphpad) durchgeführt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie die Geschwindigkeit, mit der Fragmente mit Protein (kpro) und Glutathion (kGSH) reagieren, um den Wert des Rate Enhancement Factor (REF) für jedes Fragment zu berechnen: REF = kpro / kGSH</li>
	<li>Verwenden Sie die REF-Werte, um Trefferfragmente auszuwählen. Dies kann durch Festlegen eines REF-Schwellenwerts (z. B. REF &gt; 3), einer willkürlichen Trefferquote (z. B. obere 2 %) oder durch die Auswahl von Fragmenten mit REF 3 Standardabweichungen größer als das geometrische Mittel erfolgen.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Quantitativ-irreversibles Tethering: Elektrophile Liganden effizient screenen

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
<li>Gehringer, M., Laufer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+re-emerging+warheads+for+targeted+covalent+inhibitors%3A+Application+in+medicinal+chemistry+and+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Emerging and re-emerging warheads for targeted covalent inhibitors: Application in medicinal chemistry and chemical biology.</a> J Med Chem. 62, 5673-5724 (2019).</li>
<li>Strelow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+the+kinetics+of+covalent+and+irreversible+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A perspective on the kinetics of covalent and irreversible inhibition.</a> SLAS Discov. 22 (1), 3-20 (2016).</li>
<li>Burger, J. A., Buggy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton+tyrosine+kinase+inhibitor+Ibrutinib+%28PCI-32765%29%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Bruton tyrosine kinase inhibitor Ibrutinib (PCI-32765).</a> Leukemia Lymphoma. 54 (11), 2385-2391 (2013).</li>
<li>Hocking, B., Armstrong, A., Mann, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery+-+Design%2C+synthesis+and+screening+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery - Design, synthesis and screening methods.</a> Prog Med Chem. 62, 105-146 (2023).</li>
<li>Lucas, S. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+hits+and+where+to+find+them%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Covalent hits and where to find them.</a> SLAS Discov. 29 (3), 100142(2024).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+analysis+for+target-directed+covalent+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic analysis for target-directed covalent ligand discovery.</a> Angewandte Chemie. 130, 5355-5359 (2018).</li>
<li>Kathman, S. G., Xu, Z., Statsyuk, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment-based+method+to+discover+irreversible+covalent+inhibitors+of+cysteine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Fragment-based method to discover irreversible covalent inhibitors of cysteine proteases.</a> J Med Chem. 57 (11), 4969-4974 (2014).</li>
<li>Hallenbeck, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+method+for+screening+disulfide+tethering+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography/mass spectrometry method for screening disulfide tethering fragments.</a> SLAS Discov. 23 (2), 183-192 (2019).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparamter+kinetic+analysis+for+covalent+fragment+optimization+by+using+quantitative+irreversible+tethering+%28qIT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparamter kinetic analysis for covalent fragment optimization by using quantitative irreversible tethering (qIT).</a> Chem Bio Chem. 21, 3417-3422 (2020).</li>
<li>Keeley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 25 (6), 983-996 (2020).</li>
<li>Gober, I. N., Sharan, R., Villain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+stability+of+thiol-maleimide+bioconjugates+via+the+formation+of+a+thiazine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving the stability of thiol-maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure.</a> J Pept Sci. 29 (10), e3495(2023).</li>
<li>Olp, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent-fragment+screening+of+BRD4+identifies+a+ligandable+site+orthogonal+to+the+acetyl-lysine+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites.</a> ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).</li>
<li>Qin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+fragment+inhibitors+that+induce+unprecedented+conformational+distorions+in+Entereovirus+71+3C+and+SARS-CoV-2+main+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).</li>
<li>Jamshidiha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+first+structurally+validated+covalent+ligands+of+the+small+GTPase+RAP27A%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A.</a> RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).</li>
<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

Cystein-reaktive zielgerichtete kovalente Liganden (Moleküle, die eine biologische Wirkung ausüben, indem sie mit einem ausgewählten Cysteinrest auf ein bestimmtes Protein reagieren) sind in den letzten Jahrzehnten als chemische Werkzeuge und Therapeutika immer beliebter geworden1. Diese bestehen typischerweise aus einem leicht reaktiven Elektrophil (wie einem Acrylamid, Chloracetamid oder Vinylsulfon), das an eine Ligandeneinheit mit einer hohen Affinität für ein Proteinziel2 gebunden ist. Im Idealfall verläuft die Liganden-Protein-Wechselwirkung über einen zweistufigen Mechanismus, der eine anfängliche nicht-kovalente Ligandenbindung umfasst, gefolgt von einer irreversiblen kovalenten Bindungsbildung zwischen dem Zielcystein und elektrophil3.
Mehrere frühe zielgerichtete kovalente Liganden, einschließlich des Bruton-Tyrosinkinase-Inhibitors Ibrutinib, wurden entwickelt, indem ein zuvor identifizierter reversibler Ligand mit einem elektrophilen Griffversehen wurde 4. Dieser Ansatz ist jedoch nicht immer erfolgreich, und andere Versuche haben ergeben, dass die elektrophile Installation eine erhebliche Optimierung erfordert5. Stattdessen sind elektrophile Ansätze, insbesondere unter Verwendung elektrophiler Fragmente, in den letzten Jahren immer beliebter geworden. Diese beinhalten typischerweise die Inkubation einer Bibliothek von Elektrophilen mit einem Protein und die anschließende Auswahl von Verbindungen mit einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber einem Cystein, von der angenommen wird, dass sie durch produktive nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen dem Liganden und der Bindungstascheinduziert wird 6. Insbesondere wurden diese Methoden bei der Entwicklung des KRAS (G12C)-Inhibitors Sotorasib1 erfolgreich angewendet.
Das elektrophile First-Screening stellt im Vergleich zum herkömmlichen nicht-kovalenten Liganden-Screening mehrere einzigartige Herausforderungen dar, vor allem aufgrund der hohen Variabilität der Reaktivität innerhalb und zwischen den Gefechtskopfklassen7. Die meisten Cystein-reaktiven Elektrophile reagieren im Laufe der Zeit mit allen lösungsmittelexponierten Cysteinresten, unabhängig von einer selektiven Wechselwirkung für das Zielprotein. Die Ligandenbelegung nimmt daher im Laufe der Zeit bei fast allen Elektrophilen zu, und ohne Kontrolle der Reaktivität wird die Trefferauswahl oft zugunsten reaktiverer Fragmente verzerrt sein, die ein Ziel schneller binden8.
Darüber hinaus wird bei elektrophilen Screening-Methoden häufig Massenspektrometrie verwendet, um die Bildung von Protein-Liganden-Addukten nachzuweisen, die im Durchsatz begrenzt ist9. Regelmäßige Reaktionsproben sind über einen längeren Zeitraum (Stunden bis Tage) erforderlich, um die Reaktionskinetik für eine Bibliothek von Verbindungen mit unterschiedlicher Elektrophilie richtig zu charakterisieren10. Für ein Screening von 300 Fragmenten, die zu 10-Zeitpunkten beprobt werden, müssen daher 3000 Massenspektren durchgeführt werden, was den Durchsatz der meisten Protein-Massenspektrometrie-Systeme übersteigt. Methoden mit höherem Durchsatz zur Überwachung der Protein-Liganden-Adduktbildung sind daher wünschenswert.
Der hier skizzierte Ansatz, der Quantitate Irreversible Tethering (qIT)-Assay, ist eine elektrophile Screening-Methode, die die intrinsische Reaktivität kontrolliert und eine einfache Fluoreszenzauslesung verwendet7. Protein oder Glutathion (ein unstrukturiertes, thiolhaltiges Tripeptid, das als Kontrolle für die intrinsische Reaktivität verwendet wird) werden mit einer Bibliothek elektrophiler Fragmente inkubiert, und es werden regelmäßige Proben zum Abschrecken in eine Lösung von CPM (7-Diethylamino-3-(4'-Maleimidylphenyl)-4-methylcumarin, ein fluorogenes Thiol-Quantifizierungsmittel) entnommen. Die Adduktbildung zwischen dem Cystein und dem elektrophilen Fragment reduziert die Menge an Thiol, die für die Reaktion mit CPM zur Verfügung steht, und reduziert die resultierende Fluoreszenz beim Abschrecken. Die CPM-Fluoreszenz fungiert somit als Proxy für nicht umgesetztes Thiol, wodurch die Kinetik der Thiolreaktion mit jedem elektrophilen Fragment bestimmt werden kann. Elektrophile Fragmente mit signifikant erhöhter Proteinreaktivität gegenüber Glutathion werden als Treffer ausgewählt und für die weitere Entwicklung priorisiert (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung von qIT. Ein schematischer Überblick über den qIT-Assay. (erstellt mit BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Trefferauswahl mit REF-Werten steuert die intrinsische Reaktivität und stellt sicher, dass Fragmente nur dann als Treffer ausgewählt werden, wenn sie produktive nicht-kovalente Wechselwirkungen mit einem Proteinziel eingehen. Die einfache Fluoreszenzauslesung bedeutet auch, dass der qIT-Assay hochgradig skalierbar ist und keine massenspektrometrischen Methoden der Reaktionsüberwachung erfordert.
Im Folgenden wird ein umfassendes Verfahren für den qIT-Assay skizziert, wobei Beispielergebnisse zur Veranschaulichung der Assay-Leistung und der Trefferauswahl enthalten sind.

<table><tbody><tr><td>Argongas</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-Well-Analyseplatten mit niedrigem Flansch und flachem Boden</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Immobilisiertes TCEP-Agarose-Pierce</td><td></td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR-Plattendichtungen</td><td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes L-Glutathion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

kovalentes fragment-screening mit dem quantitativen irreversiblen tethering-assay

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

Der qIT-Assay wird hier verwendet, um kovalente Fragmenttreffer für ein unbenanntes, einzelnes Cysteinprotein zu identifizieren. MgCl2 (10 mM) wurde zu den Reaktionspuffern hinzugefügt, da bekannt ist, dass das Zielprotein an Mg2+ -Ionen bindet. Das Screening wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Geschwindigkeit bestimmt, mit der jedes Fragment sowohl mit dem Zielprotein (kpro) als auch mit dem Glutathion (kGSH) reagierte. Die Z-Werte lagen bei allen Quench-Platten über 0,5 und im Durchschnitt bei 0,75 für Protein-Quenches und 0,79 für Glutathion-Quenches, was auf eine hervorragende Assay-Leistung hinweist. Die REF-Werte wurden dann für jedes Fragment berechnet, und die Treffer wurden ausgewählt, bei denen REF 3 &gt;.
Die repräsentativen Ergebnisse (Abbildung 4) sind ein Beispiel für die Trefferauswahl mit dem qIT-Assay. Verbindung 1 reagierte mit einer 6,0-fach höheren Rate mit dem Cysteinrest auf dem Zielprotein als mit Glutathion und wurde unter Verwendung eines Kriteriums von REF &gt; 3 als Treffer ausgewählt (Abbildung 4B). Diese Geschwindigkeitsbeschleunigung deutet auf das Vorhandensein eines Templating-Effekts hin, wobei nicht-kovalente Wechselwirkungen Position 1 in der richtigen Ausrichtung für das Cystein auf dem Zielprotein einnehmen, um mit dem Chloracetamid-Gefechtskopf zu reagieren. Im Gegensatz dazu ist 2 ein Beispiel für ein Non-Hit-Fragment, da die Reaktion zwischen 2 und dem Ziel-Cysteinrest relativ zur Reaktion zwischen 2 und Glutathion nicht beschleunigt wird. Das Fehlen einer Geschwindigkeitsbeschleunigung deutet darauf hin, dass es keine produktiven nicht-kovalenten Wechselwirkungen gibt, die 2 in der richtigen Ausrichtung positionieren, um mit dem Ziel-Cysteinrest zu reagieren.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen ein Monitoring der Protein- und Glutathionreaktion durch qIT auf (A) eine hohe intrinsische Reaktivität, ein mögliches falsch-positives Trefferfragment und (B) ein Trefferfragment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Kovalentes Fragment-Screening mit dem quantitativen irreversiblen Tethering-Assay

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

covalent-fragment-screening-using-quantitative-irreversible-tethering

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragmentanalyse diskutiert, die eine schnelle und effiziente direkte Messung der Telomerlänge ermöglicht. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Zellquellen von DNA zur Quantifizierung der Telomerlänge angewendet werden.

Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

Dieses Protokoll beschreibt die kovalente Immobilisierung von Proteinen mit einer Heterobifunctional Silan Haftvermittler auf Siliziumoxid Oberflächen für die atomic Force Mikroskopie basierend Einzelmolekül Kraft Spektroskopie entwickelt die am Beispiel der Interaktion von RrgA (Pilus-1 Tipp adhäsin des Streptococcus Pneumoniae) mit Fibronektin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Mit Hilfe von Quantenpunkt-markierter DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie können wir den Reaktionsmechanismus von Restriktionsendonukleasen untersuchen, während wir unmarkierte Proteine verwenden. Diese Einzelmolekültechnik ermöglicht die massiv gemultiplexte Beobachtung einzelner Protein-DNA-Wechselwirkungen, und Daten können gepoolt werden, um gut bevölkerte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

Das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin erfolgt über einen Workflow mit dedizierten Compound-Bibliotheken, Kristall-Handling-Tools, schnellen Datenerfassungsmöglichkeiten und weitgehend automatisierter Datenanalyse. Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, den Output solcher Experimente zu maximieren, um vielversprechende Ansatzpunkte für das nachgelagerte strukturbasierte Ligandendesign zu schaffen.

Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin

Das fragmentbasierte Screening mittels NMR ist eine robuste Methode zur schnellen Identifizierung von niedermolekularen Bindemitteln an Biomakromoleküle (DNA, RNA oder Proteine). Es werden Protokolle vorgestellt, die die automatisierungsbasierte Probenvorbereitung, NMR-Experimente und Aufnahmebedingungen sowie Analyse-Workflows beschreiben. Die Technik ermöglicht die optimale Nutzung von 1H und 19F NMR-aktiven Kernen für den Nachweis.

NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Dieser Artikel beschreibt den kompletten XChem-Prozess für kristallbasiertes Fragment-Screening, beginnend mit der Beantragung des Zugangs und allen nachfolgenden Schritten bis hin zur Datenverbreitung.

Effizientes Fragment-Screening in der XChem-Anlage an der Diamond Light Source

Die Überwachung von Änderungen der Schmelztemperatur eines Zielproteins(z. B.Thermal Shift Assay, TSA) ist eine effiziente Methode zum Screening von Fragmentbibliotheken von einigen hundert Verbindungen. Wir präsentieren ein TSA-Protokoll, das eine robotergestützte Nano-Differential Scanning Fluorimetry (Nano-DSF) zur Überwachung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz und der Lichtrückstreuung für das Fragmentscreening implementiert.

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.

Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur biophysikalischen Charakterisierung der ternären Komplexbildung, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert wird, an denen die Ubiquitin-Ligasen Von-Hippel-Lindau E3-Ligase (VHL) und Cereblon (CRBN) beteiligt sind.  Zu den hier dargestellten biophysikalischen Methoden gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC).

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Erfahren Sie das quantitative irreversible Tethering (qIT) für die kovalente Fragment-Screening. Diese fluoreszenzbasierte Methode identifiziert selektive kovalente Liganden für Arzneimittelziele ohne Massenspektrometrie.

Kovalentes Fragment-Screening mit dem quantitativen irreversiblen Tethering-Assay

Weitere Videos entdecken