Name: Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die mitochondriale Atmung in lebenden Hefezellen quantifizieren, um zelluläre Bioenergetik zu untersuchen. Diese Methode hilft Forschern, die Wirkung von Polyphenolen auf mitochondriale Funktionen zu verstehen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Messung der mitochondrialen Hefeatmung unter Beibehaltung des zellulären Kontexts

<ol><li>Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+respiration+within+cells+with+increased+open+pore+cytoskeletal+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes.</a> Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).</li>
<li>Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+rotor+components+of+yeast+mitochondrial+ATP+synthase+are+mechanically+coupled+by+subunit+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).</li>
<li>Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+metabolism+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in metabolism and cell death.</a> Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).</li>
<li>Matus-Ortega, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+complexes+containing+the+internal+alternative+NADH+dehydrogenase+%28Ndi1%29+in+mitochondria+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).</li>
<li>Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+pumping+complex+I+increases+growth+yield+in+Candida+utilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys%22%5BJournal%5D)">Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis.</a> Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Respiratory chain supercomplexes.</a> IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).</li>
<li>Lasserre, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+system+for+modeling+mitochondrial+disease+mechanisms+and+discovering+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies.</a> Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).</li>
<li>Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B%2FATP+ratio+of+proton+transport-coupled+ATP+synthesis+and+hydrolysis+catalysed+by+CF0F1-liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes.</a> EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles.</a> Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li>
<li>Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alternative+respiration+system+of+Scheffersomyces+stipitis+and+effect+on+glucose+or+xylose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation.</a> FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snf1p%2FHxk2p%2FMig1p+pathway+regulates+hexose+transporters+transcript+levels%2C+affecting+the+exponential+growth+and+mitochondrial+respiration+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae.</a> Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).</li>
<li>Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+potential+of+yeast+cells+depends+on+overall+action+of+interconnected+changes+in+central+carbon+metabolism%2C+cellular+biosynthetic+capacity%2C+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+is+required+to+provide+amino+acids+during+fermentative+proliferation+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast.</a> EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+quercetin+is+related+to+mitochondrial+respiration+impairment+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).</li>
<li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li>
<li>Gancedo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+carbon+catabolite+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Yeast carbon catabolite repression.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (2), 334-361 (1998).</li>
<li>Katzmann, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+ATP-binding+cassette+transporter-encoding+gene+%28YOR1%29+is+required+for+oligomycin+resistance+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).</li>
<li>Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+increases+glycolytic+flux+in+Saccharomyces+cerevisiae+via+a+SNF1-dependet+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerr+Biomemb%22%5BJournal%5D)">Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism.</a> J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).</li>
<li>Gueguen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+directly+binds+to+mitochondrial+complex+I+and+increases+oxidative+stress+in+brain+mitochondria+of+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice.</a> PloS One. 10 (12), e0144290(2015).</li>
<li>Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+and+cytochrome+c+are+molecular+targets+of+flavonoids+that+inhibit+hydrogen+peroxide+production+by+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).</li>
<li>de Oliveira, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+and+the+mitochondria%3A+A+mechanistic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view.</a> Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrillo-Garmendia%2C+A+%22Mol+Cell+Biochem%22">Mol Cell Biochem</a>. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Thenoyltrifluoraceton (TTFA)</td><td>Merck</td><td>T27006</td><td>Inhibitor-Komplex II</td></tr><tr><td>3-Chlorphenylhydrazon-Carbonylcyanid (CCCP)</td><td>Merck</td><td>C2759</td><td>Mitochondrien-Entkoppler für die Atmung &nbsp;</td></tr><tr><td>Absolut ethanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>Zum Auflösen von Quercetin</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Merck</td><td>A1296</td><td>YPD Agar Zubereitung</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat granuliert (NH4)2SO4</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-05</td><td>SC Bouillon</td></tr><tr><td>Zubereitung Antimycin A (AA)</td><td>Merck</td><td>A8674</td><td>Inhibitor Komplex III</td></tr><tr><td>aYSI5300A</td><td>----</td><td>----</td><td>Monitor&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Hermle</td><td>Z 206 A</td><td>Für die Zentrifugation</td></tr><tr><td>von Zellen Clark-Typ Sauerstoff</td><td>----</td><td>----</td><td>Elektrode&nbsp;</td></tr><tr><td>Computer</td><td>----</td><td>----</td><td>Für die Datenerfassung&nbsp;</td></tr><tr><td>Dikaliumphosphat K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-05</td><td>SC Brühezubereitung</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>YPD Brühezubereitung</td></tr><tr><td>Glycerinol</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td>Substrat Medium Supplementierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Laktat</td><td>Merck</td><td>L1250</td><td>Substrat Medium Supplementierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomycin aus Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>Hemmung der mitochondrialen ATP-Synthase</td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHKE6000</td><td>Inoculum Inkubation Glasröhrchen und -kolben&nbsp;</td></tr><tr><td>Pepton aus Kasein, enzymatischer Aufschluss</td><td>Merck</td><td>82303</td><td>YPD Brühe</td></tr><tr><td>Zubereitung Quercetin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>337951</td><td>Zur Verringerung der mitochondrialen Atmung</td></tr><tr><td>Uracil&nbsp;</td><td>Merck</td><td>U0750</td><td>SC Brühezubereitung</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Merck</td><td>Y1625</td><td>YPD Brühezubereitung</td></tr><tr><td>Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat</td><td>Merck</td><td>Y1251</td><td>SC Brühezubereitung</td></tr><tr><td>Hefe Synthetisches Drop-out-Medium Ergänzungen ohne Uracil</td><td>Merck</td><td>Y1501</td><td>SC Brühezubereitung</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der mitochondrialen atmung in ganzen hefezellen

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Diese mitochondriale Atmungstechnik kann auch für andere Hefearten als S. cerevisiae verwendet werden, wie z. B. Scheffersomyces stipitis15 und K. marxianus16. Zu repräsentativen Zwecken stellen wir jedoch nur Ergebnisse von S. cerevisiae vor. Es ist allgemein bekannt, dass S. cerevisiae bei niedrigen Glukosekonzentrationen (unter 0,8 mM) einen vorherrschenden respiratorischen Stoffwechsel aufweist17,18. Um den respiratorischen Phänotyp von S. cerevisiae zu bestätigen, wurde es in zwei Glukosekonzentrationen zur Stimulierung (0,5 % Glukose) und zur Begrenzung (5 % Glukose) der mitochondrialen Atmung gezüchtet18,19. Erwartungsgemäß validieren die Ergebnisse der basalen Atmung (oxidierbares Substrat), der ATP-gebundenen Atmung (Oligomycin) und der maximalen Atmungskapazität (CCCP) den charakteristischen Energiestoffwechsel von S. cerevisiae (Abbildung 2). Wir beobachteten höhere Werte des Sauerstoffverbrauchs (basale Atmung, ATP-gebundene Atmung und maximale Atmungskapazität) in Zellen, die mit 0,5 % Glukose gezüchtet wurden, verglichen mit Werten, die in Zellen mit 5 % Glukose gewonnen wurden (Abbildung 2).
Darüber hinaus wurden in den Assays drei Substrate verwendet: Glukose, Glycerin und L-Laktat. Das Ziel des Einsatzes verschiedener Substrate ist es, verschiedene Teile der mitochondrialen Atmungskette zu bewerten. Unter diesen Bedingungen zeigte die mitochondriale Atmung keine signifikanten substratabhängigen Veränderungen, da keine Behandlung zur Störung der Atmungskette hinzugefügt wurde (Abbildung 2).
Wir verwendeten Quercetin, um die Kapazität der Technik zu bewerten, eine Verbindung, die die mitochondriale Atmung negativ beeinflusst20. Die erhaltenen Daten zeigten, dass Quercetin die mitochondriale Atmung in Zellen, die in Medien gezüchtet wurden, die mit 0,5 % Glukose angereichert waren, signifikant verringerte (Abbildung 3). Auf der anderen Seite zeigten Zellen, die in Medien gezüchtet wurden, die mit 5 % Glukose angereichert waren, keinen signifikanten negativen Einfluss von Quercetin (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Repräsentative Sauerstoffverbrauchskurve. Kurve des Sauerstoffverbrauchs in S. cerevisiae-Zellen , die in SC-Medien gezüchtet wurden (0,5 % Glukose). Die Farben repräsentieren unterschiedliche Steigungen, die bei Substrat, Entkopplern und Inhibitorergänzung erhalten werden. Grün: Das Substrat nutzte Glukose und die steigungsentsprechende basale Atmung. Blau: Oligomycin, ATP-Synthase-Inhibitor, Steigung zur Bestimmung der ATP-gebundenen Atmung. Gelb: CCCP, Entkoppler, Steigung zur Bewertung der maximalen Atmung. Grau und Rot: Inhibitorkomplex II bzw. III; Steigung zur Bestimmung des nicht von Mitochondrien abhängigen Sauerstoffverbrauchs. Abkürzungen: CCCP = 3-Chlorphenylhydrazoncarbonylcyanid; TTFA = 2-Thenoyltrifluoraceton; AA = Antimycin A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Sauerstoffverbrauchsassays in S. cerevisiae-Zellen, die mit 0,5 % und 5 % Glukose gezüchtet wurden. Die mitochondriale Atmung wird durch den Sauerstoffverbrauch bewertet, der bei der basalen Atmung, der maximalen Atmungskapazität und der ATP-gebundenen Atmung in S. cerevisiae-Zellen gemessen wird, die in SC gezüchtet und mit 0,5 % und 5 % Glukose ergänzt wurden. Drei Substrate wurden verwendet, um ihren spezifischen Einfluss auf die Elektronentransportkette zu bewerten: Glukose (NADH-Dehydrogenasen), Glycerin (Ubichinonpool) und L-Lactat (Cytochrom c). (A) Basale Atmung bei 5 % und 0,5 % Glukose mit Glukose, Glycerin und L-Laktat als Substrate; (B) maximale Atmung bei 5 % und 0,5 % Glukose mit Glukose, Glycerin und L-Laktat als Substrate; (C) ATP-gebundene Atmung bei 5 % und 0,5 % Glukose mit Glukose, Glycerin und L-Laktat als Substrat. Die Ergebnisse werden als mittlere ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt, wobei jedes Experiment zwei technische Wiederholungen hat. Einfache ANOVA gefolgt vom Tukey-Test (p ≤ 0,05; verschiedene Buchstaben: signifikanter Unterschied, gleiche Buchstaben: kein signifikanter Unterschied) für die statistische Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig03_.jpg"> 
Abbildung 3: Quercetin begrenzte die mitochondriale Atmung bei niedriger Glukosekonzentration in gezüchteten S. cerevisiae-Zellen . Die Messung des Sauerstoffverbrauchs wurde bei der basalen Atmung, der maximalen Atmungskapazität und der ATP-gebundenen Atmung in S. cerevisiae-Zellen durchgeführt, die in SC-Medien (0,5 % Glukose) mit Quercetin (100 μM) gezüchtet wurden. Ethanol wurde verwendet, um die Quercetin-Lösung aufzulösen. Die Ergebnisse werden als mittlere ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt, wobei jedes Experiment zwei technische Wiederholungen hat. Die statistischen Analysen wurden unter Verwendung eines studentischen t-Test-Paares (*, ** p ≤ 0,05) durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig03_large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig04_.jpg"> 
Abbildung 4: Quercetin beeinflusst die mitochondriale Atmung bei hohen Glukosekonzentrationen in S. cerevisiae nicht. Der Sauerstoffverbrauch wurde bei der basalen Atmung, der maximalen Atmungskapazität und der ATP-gebundenen Atmung in S . cerevisiae-Zellen gemessen, die in SC-Medien (5 % Glukose) mit Quercetin (100 μM) gezüchtet wurden. Ethanol wird verwendet, um die Quercetin-Lösung aufzulösen. Die Ergebnisse zeigen mittlere ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei technischen Wiederholungen. Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des gepaarten t-Tests der Studierenden durchgeführt (p ≤ 0,05; ns: nicht signifikant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig04_large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

mitochondrial-respiration-quantification-in-yeast-whole-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.

Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.

Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Die Beurteilung der oxidativen Phosphorylierung mit hochauflösenden Respirometern ist zu einem integralen Bestandteil der Funktionsanalyse von Mitochondrien und zellulärem Energiestoffwechsel geworden. Hier stellen wir Protokolle für die Analyse des zellulären Energiestoffwechsels mit kammer- und mikroplattenbasierten hochauflösenden Respirometern vor und diskutieren die wichtigsten Vorteile jedes Geräts.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Bioenergetik in Zellen und Geweben mittels kammer- und plattenbasierter Respirometer

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Erfahren Sie, wie Sie die mitochondriale Atmung in lebenden Hefezellen quantifizieren, um zelluläre Bioenergetik zu untersuchen. Diese Methode hilft Forschern, die Wirkung von Polyphenolen auf mitochondriale Funktionen zu verstehen.

Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen

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