Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen

Die mitochondriale Atmung ist in den meisten Fällen ein prinzipieller Generator von zellulärer Energie und ein wichtiger Indikator für den Zellstoffwechsel und die Fitness. Die mitochondrialen Funktionen beschreiben also den bioenergetischen zellulären Zustand. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in lebenden G-Zellen als bioenergetischen Parameter.

Die in diesem Protokoll beschriebene Technik hilft uns, den bioenergetischen Mechanismus einiger Polyphenole wie Resveratrol und Coirciten zu definieren. Es dient auch als Werkzeug zur Messung des Pentosestoffwechsels, auch von PTSPTs und erklärt die bioenergetische Veränderung hinter dem Baum und die Auswirkungen der Bodenarbeit. Wir sind daran interessiert zu entschlüsseln, wie Zellen einige Phänotypen erwerben, wie z.B. Baum- und Bodenarbeitseffekte, mit signifikanten Veränderungen in der zellulären Bioenergetik.

Die mitochondriale Atmung ist ein wesentliches Instrument, um die molekularen Mechanismen hinter diesem Stoffwechselphänomen aufzuklären. Beimpfen Sie zunächst ein 10-Milliliter-Reagenzglas aus Glas, das drei Milliliter YPD-Medium enthält, mit 250 Mikrolitern mit Glycerin konservierten Hefezellen. Inkubieren Sie das Reagenzglas über Nacht bei 30 Grad Celsius unter ständigem Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute.

Streifen Sie dann mit einer sterilen Schlaufe eine YPD-Schneckenplatte mit den Hefezellen, die im 10-Milliliter-Glasreagenzglas gezüchtet wurden. Inkubieren Sie die Petrischale bei 30 Grad Celsius, bis isolierte Kolonien entstehen. Um ein Prä-Inokulum herzustellen, inokulieren Sie drei Milliliter YPD-Medium mit 2 % Glukose mit zwei oder drei isolierten Hefekolonien und inkubieren.

Anschließend erhalten Sie 100 Milliliter steriles synthetisches Komplettmedium in einem 500 Milliliter Erlenmeyerkolben. Beimpfen Sie das Medium mit der Prä-Inokulum-Hefekultur über Nacht bei einer anfänglichen optischen Dichte von 0,1 bei 600 Nanometern. Fügen Sie die chemische Herausforderung hinzu, z. B. 100 mikromolares Resveratrol, um die mitochondriale Atmung zu testen.

Gießen Sie anschließend die Zellen der mittleren logarithmischen Phase in ein leeres, vorgewogenes konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 4.000 g. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, waschen Sie das Pellet dreimal mit 25 Millilitern entionisiertem Wasser. Wiegen Sie das konische Rohr mit dem gewaschenen Pellet, um das Nassgewicht zu erhalten, indem Sie das Gewicht des leeren Rohrs abziehen.

Suspendieren Sie dann das gewaschene Pellet wieder in zwei Millilitern entionisiertem Wasser. Zu Beginn erhalten Sie die Hefezellen, die mit geeigneten Medikamenten wie Resveratrol behandelt wurden. Geben Sie fünf Milliliter 10 Millimolar MES-TEA-Puffer und 50 Milligramm Feuchtzellen in die polare Transplantatkammer.

Positionieren Sie die Sauerstoffelektrode vom Typ Clark vorsichtig und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen bilden. Schalten Sie den Monitor YSI 5300A und den Datenerfassungscomputer ein. Wählen Sie Kanal eins auf Luft und stellen Sie Kanal eins mit dem Kalibrierungsregler für Kanal eins auf 100 % ein.

Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten und beginnen Sie mit der Zeitmessung mit einem Chronometer. Geben Sie das oxidierbare Substrat mit einer Chromatographiespritze bis zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar hinzu und halten Sie die Kammer unter ständigem Rühren geschlossen. Fügen Sie dann mit einer Chromatographiespritze Oligomycin hinzu, um eine Endkonzentration von 0,01 Millimolar in der Oximeterkammer zu erhalten, und zeichnen Sie den prozentualen Luftverbrauch auf.

In ähnlicher Weise wird CCCP in der Oximeterkammer bis zu einer Endkonzentration von 0,015 Millimolar zugegeben, um die maximale Atmungskapazität zu bestimmen. Als nächstes fügen Sie Elektronentransportkettenhemmer, Zahn- und Öltriflurositon oder TTFA in einer Menge von einem Millimolar hinzu, gefolgt von Antimycin A in einer Menge von einem Milligramm pro Milliliter. Waschen Sie die Kammer dreimal mit jeweils 70 % Ethanol, gefolgt von entionisiertem Wasser, bevor Sie zur nächsten Kohlenstoffquelle übergehen.

Führen Sie zunächst einen Sauerstoffverbrauchstest mit Hefezellen durch, bei dem verschiedene Kohlenstoffquellen und -kontrollen verwendet werden. Legen Sie in der Statistiksoftware eine neue Projektdatei an und wählen Sie im Erstellen-Bereich XY. Drücken Sie dann die Eingabetaste oder importieren Sie Daten in eine neue Tabelle im Abschnitt Datentabelle.

Wählen Sie im Optionsbereich Zahlen im Unterabschnitt X und im Unterabschnitt Y aus. Klicken Sie auf Geben Sie drei Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten ein. Geben Sie die Zeitdaten in die X-Spalten ein, und geben Sie die Luftprozentsätze in den Y-Spalten ein.

Um eine lineare Regressionsanalyse durchzuführen, klicken Sie in der Menüleiste auf Analysieren, wählen Sie unter Analyse die Option Einfache lineare Regression bei XY-Analyse aus, und klicken Sie dann auf OK. Rufen Sie den Neigungswert aus dem Ergebnisbereich in Datentabellen ab. Kopieren Sie die berechneten Neigungswerte in ein Datenblatt.

Subtrahieren Sie den Steigungswert, der aus der Mischung der Ateminhibitoren erhalten wurde, von denen des oxidierbaren Substrats, des Oligomycins und des CCCP, um andere Sauerstoffverbrauchsquellen zu verwerfen. Multiplizieren Sie nun die Steigungswerte mit 237 Mikromolar Sauerstoff, was die Löslichkeit von Sauerstoff in diesem Zustand darstellt, und puffern Sie. Konvertieren Sie die Werte in mikromolare Sauerstoffwerte pro Minute und passen Sie sie entsprechend der dargestellten Zeit an.

Teilen Sie die Ergebnisse durch 50, was den Milligramm der im Experiment verwendeten Zellen entspricht. Schließlich wird der Sauerstoffverbrauch als Mikromolar Sauerstoff pro Milligramm Zellen pro Minute ausgedrückt. Zellen, die in 0,5 % Glukose gezüchtet wurden, zeigten einen signifikant höheren Sauerstoffverbrauch bei der Basalatmung, der ATP-gebundenen Atmung und der maximalen Atmungskapazität im Vergleich zu solchen, die in 5 % Glukose gezüchtet wurden.

Quercetin reduzierte signifikant die mitochondriale Atmung in Zellen, die mit 0,5 % Glukose gezüchtet wurden, was sich auf die basale, ATP-gebundene und maximale Atmung auswirkte. Auf der anderen Seite beeinflusste Quercetin die mitochondriale Atmung in Zellen, die in 5% Glukose gezüchtet wurden, nicht signifikant.