Name: Optimierte und vereinfachte Technik für die Herstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Erfahren Sie die optimierte Herstellung und Kultivierung präzisionsgeschnittener Leberscheiben aus Mäusen. Dieses Vibratom-Verfahren ermöglicht eine Kulturdauer von mindestens vier Tagen für metabolische Studien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Standardisiertes Protokoll für die Kultivierung von Leberschnitten in einfachen Laborumgebungen

<table><tbody><tr><td>3 cm Petrischale</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>6, 12, 24 Wells Kulturplatte</td><td>Beliebig</td><td></td><td>Geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>Cyanacrylat Sekundenkleber</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Einsätze 8um, für 12 Well Platten</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>Einsätze 8um, für 24 Well Platten</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>Einsätze 8um, für 6 Well Platten</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td></td><td></td><td>Hepa-Luftfiltration</td></tr><tr><td>Niedrigschmelzende Agarose&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>MTS Tetrazolium-Reagenz&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Well-Plattenlesegerät&nbsp;</td><td>Alle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Alle</td> Chirurgische Zange Alle <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>mit</td><td></td><td>einer flachen quadratischen Spitze&nbsp;</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S William</td><td></td></tr><tr><td>' s Medium E mit GlutaMAX (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierte und vereinfachte technik für die herstellung und kultivierung von präzisionsgeschnittenen leberscheiben

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

Bei der Entnahme wird bewusst auf die Durchblutung des Tieres verzichtet, um eine schnelle Verarbeitung des Organs zu gewährleisten und Organschäden zu vermeiden. Die Leber wird schnell nach der Inzision extrahiert und sofort in einen eiskalten Organschutzpuffer, z. B. Krebspuffer24,29, gelegt. Obwohl das Schneiden von frischem Lebergewebe ohne Einbettung bereits zuvor beschrieben wurde1, ermöglicht die Einbettung der Leber in niedrigschmelzende Agarose30 (Abbildung 1) in Kombination mit einem organschützenden Puffer optimale Schnittbedingungen auf dem Vibratom, wodurch Gewebeschäden reduziert und die Reproduzierbarkeit in der Schnittdicke erhöht wird. Die Gewebedicke ist entscheidend, da dünne Schnitte mehr Zellschichten den Zugang zu Nährstoffen und Sauerstoff ermöglichen31 und den Zelltod reduzieren. Zu dünne Abschnitte lassen sich jedoch nur schwer homogen schneiden. Umgekehrt weisen Scheiben mit einer Dicke von mehr als 400 μm eine geringere Durchdringungsrate von Nährstoffen auf. Die Schnitte wurden unter Verwendung eines Einsatzes in einer Flüssig-Luft-Grenzfläche inkubiert (Abbildung 1) und mit 5 % CO2 und 21 % O2 bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Die Schnitte sind innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme in einem Kulturmedium zu inkubieren, wonach der Zelltod schnell eintritt32.
Um die Lebensfähigkeit von PCLS zu bestimmen, wurde die Zellviabilität mittels 4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) Assay bestimmt, der NAD(P)H-abhängige Dehydrogenasen, d.h. metabolisch aktive Zellen, benötigt, um MTS zu reduzieren. Die MTS-Werte wurden auf das jeweilige Scheibengewicht normiert. Um die Lebensfähigkeit von PCLS zu optimieren, war ein minimales Volumen an Kulturmedium unerlässlich, um die Lebensfähigkeit nach 24 Stunden Inkubation aufrechtzuerhalten. Ein Volumen von 0,7 mL in 24-Well-Platten zeigte eine signifikante Verringerung der Viabilität durch TMS-Assay (p = 0,02) im Vergleich zu 1,5 mL in 12-Well-Platten und 2,6 mL in 6-Well-Platten (Abbildung 2A). Diese Volumina wurden so gewählt, dass die Abschnitte leicht abgedeckt werden können, aber sie müssen je nach Art der verwendeten Einsätze und Platten möglicherweise angepasst werden. Wie bei anderen33 werden 12-Well-Platten als bester Kompromiss für ein optimales Überleben in einem kleineren Volumen des Kulturmediums verwendet.
Schütteln ist unerlässlich und erhöht die Lebensfähigkeit des PCLS 24 Stunden nach der Inkubation um 50 % im Vergleich zu einer statischen Kultur (Abbildung 2B). Durch das Schütteln entsteht eine kritische Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, die durch den Einsatz von Transwells optimiert wurde und den Zugang zu Nährstoffen und Sauerstoff auf beiden Seiten des Abschnitts ermöglicht. Die Aufnahme von Sauerstoff und Nährstoffen wird auch durch die konstante Strömung erhöht, die durch die Schüttelbewegung entsteht und auch durch die Transwell-Membran fließt.
Der MTS-Assay wurde von 1 h Inkubation bis zum 6. Tag der Inkubation bewertet. Die Zellviabilität blieb von Tag 0 bis Tag 4 nach der Inkubation konstant, bevor an Tag 6 eine signifikante Abnahme (p = 0,05) beobachtet wurde (Abbildung 2C). Die PCLS-Morphologie, die durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&amp;E) beurteilt wurde, zeigte bis zu 5 Tage nach der Inkubation keine Veränderung der Gallengänge und der Architektur (Abbildung 3A-D). Im Vergleich zu Tag 0 (Abbildung 3A) zeigte das PCLS an Tag 1 (Abbildung 3B) und Tag 2 (Abbildung 3C) nach der Inkubation keinen histologischen Unterschied, mit nukleärer Hyperchromasie, leichtem inflammatorischem Infiltrat, Vakuolisierung zugunsten eines moderaten Zelltodprozesses an Tag 5 nach der Inkubation (Abbildung 3D). Zusammengenommen ermöglicht dieses PCLS-Kulturprotokoll eine Lebensfähigkeit von mindestens 4 Tagen, was mit Studien übereinstimmt, in denen Scheiben unter ähnlichen Bedingungen verwendet wurden31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung des Protokolls zur Generierung von PCLS. Diese Zahl wurde von34 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Das optimierte Protokoll der PCLS-Kultur zeigt eine zufriedenstellende Lebensfähigkeit für 5 Tage. (A) Einfluss der Well-Größe auf die Zellproliferation (n=3). (B) Wirkung des Schüttelns auf die Zellproliferation (n=6 pro Zustand). (C) MTS-Zellproliferationsassay aus Leberschnitten von d0 bis d6 Tagen Inkubation (n=5 pro Zeitpunkt). OD beliebige Einheit, normiert auf das Frischgewicht der Schicht. Das Diagramm zeigt den Mittelwert ± SD. Unpaariger 2-seitiger Student-t-Test, ns = nicht signifikant, *p&lt;0,05, **p&lt;0,01. Diese Zahl wurde von34 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Histologische Ergebnisse. (A-D) Repräsentative Bilder der Histologie von Leber-PCLS nach H&amp;E-Färbung. Maßstabsleiste = 100 μM. Diese Zahl wurde von34 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Optimierte und vereinfachte Technik für die Herstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

optimized-simplified-technique-for-production-culture-precision-cut

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Organotypische Explantatkulturen aus Primärgewebe, die präzisionsgeschnittene Scheiben enthalten, repräsentieren die dreidimensionale (3-D) Gewebearchitektur sowie die multizellulären Wechselwirkungen von nativem Gewebe. Dieses Video beschreibt die Kultivierung von Gewebeschnitten aus Lungentumoren der Maus unter Verwendung einer rotierenden Inkubationseinheit, einem System, das eine intermittierende Exposition des Gewebes gegenüber Sauerstoff und Nährstoffen ermöglicht. Das Protokoll...

Explantatkultur aus Lungentumorgewebe: Ein Verfahren zur Erzeugung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Lungentumorschnitten

In diesem Video beschreiben wir ein Verfahren, um isolierte menschliche Lungen mit Agarose aufzublasen und menschliche präzisionsgeschnittene Lungenscheiben vorzubereiten. Die präparierten ex vivo Lungenschnitte können für weitere immunologische Experimente verwendet werden.

Agarose-basierte Aufbereitung von menschlichen, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Herstellung von lebensfähigen präzisionsgeschnittenen Leberscheiben von Mäusen. Die Ex-vivo-Gewebeproben können mehrere Tage lang unter Labor-Gewebekulturbedingungen aufbewahrt werden, was ein flexibles Modell zur Untersuchung der Leberpathobiologie bietet.

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Hier wird ein Protokoll zur Erhaltung der vaskulären Kontraktilität von PCLS-murinem Lungengewebe vorgestellt, was zu einem anspruchsvollen dreidimensionalen Bild des Lungengefäßsystems und der Atemwege führt, das bis zu 10 Tage konserviert werden kann und für zahlreiche Verfahren anfällig ist.

Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Dieses Video zeigt das Protokoll eines in-vitro-Angiogenese-Assay, rekapituliert mehrere Stufen der Angiogenese. Zeitraffer-Bilder von Keimen, Lumenbildung, Verzweigung und Anastomose - die wichtigsten Merkmale der Angiogenese - gezeigt werden.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von KLRG1 Tetramer, die ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse von KLRG1 Liganden ist.

Ein Protokoll für die Produktion von KLRG1 Tetramer

Whole Embryo Kultur Technik ermöglicht es uns, Kultur Maus und Ratte...

Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System

Erfahren Sie die optimierte Herstellung und Kultivierung präzisionsgeschnittener Leberscheiben aus Mäusen. Dieses Vibratom-Verfahren ermöglicht eine Kulturdauer von mindestens vier Tagen für metabolische Studien.

Optimierte und vereinfachte Technik für die Herstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben

Weitere Videos entdecken