Optimierte und vereinfachte Technik für die Herstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben

Die Protokolle für die Herstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberschnitten (PCLS) können drastisch variieren. Der Hauptnachteil von PCLS ist ihre kurze Halbwertszeit, aber hier zeigen wir, dass die Produktion und Kultivierung von PCLS unter Standardlaborbedingungen mit Zugang zu Vibratome erreicht werden kann und gleichzeitig eine Halbwertszeit von mindestens vier Tagen gewährleistet ist. PCLS, ein ansprechendes Modell, das die Lücken zwischen In-vitro- und In-vivo-Modellen füllt, aber aufgrund ihrer relativ kurzen Halbwertszeit oft vernachlässigt wird. Sie enthalten jedoch alle Zelltypen und eine konservierte Architektur, die für die metabolische Summierung unerlässlich ist, und ähneln daher einem Mini-Modell des gesamten Organs, das die Untersuchung und Behandlung von lebenden Geweben ermöglicht, während ihre komplexen Phänotypen repliziert werden. Kontinuierliche Scheiben sind ein sehr einfacher Prozess, aber technisch anspruchsvoll. Um dies zu erleichtern, konzentriert sich unser Protokoll auf wichtige Schritte, wie z. B. die Ausrichtung des Schnitts und die Einbettung des Gewebes, aber auch auf die Relevanz eines Mini-Modellvolumens für die Kultur und eines dynamischen Systems zur Erhöhung ihrer Halbwertszeit.

[Erzähler] Bereiten Sie vor der Ernte einen Liter Krebs-Henseleit-Puffer, eine desinfizierte und gekühlte Vibratome-Schale, autoklavierte Vibratome-Klingen und 4 % niedrigschmelzende Agarose vor. Bewahren Sie die geschmolzene Agarose am Tag der Ernte bis zur Verwendung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Bereiten Sie als Nächstes die Kulturplatten vor, indem Sie 2,6, 1,5 und 0,7 Milliliter des vollständigen Mediums pro Vertiefung in Sechs-, 12- bzw. 24-Well-Platten geben. Setzen Sie acht Mikrometer große poröse Einsätze in jede Vertiefung ein. Legen Sie die Platten in einen befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und 21 % Sauerstoff. Sterilisieren Sie alle für die Ernte benötigten Instrumente mit geeigneten Sterilisationsmethoden. Besprühen Sie den Bauch der euthanasierten Maus mit 70%igem Ethanol, um den Bereich zu desinfizieren. Schneiden Sie mit einer sterilen Pinzette und einer Schere die Haut und das Bauchfell von der Mitte des Bauches ab, um die Bauchhöhle zu öffnen. Präparieren Sie die Leber vorsichtig von den umliegenden Organen oder Gefäßen, ohne die Lappen zu beschädigen. Lagern Sie dann die ganze Leber sofort in eiskaltem Krebspuffer. Trennen Sie mit einer stumpfen Pinzette und einem scharfen, sterilen Messer oder einer Schere jeden Lappen einzeln, um eine Beschädigung der Lappen während der Trennung zu vermeiden. Schneiden Sie mit einem scharfen, sterilen Messer alle Kanten des gewählten Lappens ab, um gerade, handliche Kanten zum Einbetten zu schaffen. Gießen Sie dann die 4% niedrigschmelzende Agarose in eine drei Zentimeter große Petrischale, die auf nasses Eis gestellt wird, um gleichmäßig abzukühlen und ein Absinken des Lappens zu verhindern. Lassen Sie die Agarose weitere 30 Sekunden abkühlen und legen Sie den abgeschnittenen Lappen in die Mitte der Agarose, damit er sich in der Mitte des Blocks absetzen kann. Schneide dann die Außenkanten des Agarose-Blocks ab und löse den Agarose-Block von der Schale. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite und die mit der Vibratome-Plattform verklebte Seite parallel zur Oberkante des Lappens verlaufen. Stellen Sie zunächst das Vibratom so ein, dass es mit einer Dicke von 250 Mikrometern mit einer Geschwindigkeit von fünf und einer Frequenz von sieben Hertz schneidet. Nachdem Sie das Vibratome sterilisiert und das Tablett auf das Vibratome gestellt haben, umgeben Sie es mit Eis, um die Umgebung kalt zu halten. Stellen Sie die Klingen in einem Winkel von 10 Grad nach unten von der horizontalen Ebene aus ein. Füllen Sie dann den Vibratome-Tank mit eiskaltem Krebs-Puffer. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Plattform auf, um sie für die Montage des Agaroseblocks vorzubereiten. Trocknen Sie anschließend die Kante des Agaroseblocks, der auf die Plattform geklebt wird, mit sterilem saugfähigem Gewebe. Lege nun den Agaroseblock auf die abnehmbare Plattform des Vibratome. Positionieren Sie den Leberlappen aufrecht, um Querschnitte zu ermöglichen, was den Druck auf den Lappen reduziert und einen glatteren Schnitt ermöglicht. Warten Sie eine Minute, bis der Kleber ausgehärtet ist, und tauchen Sie die Plattform in den Vibratome-Tank ein, um sicherzustellen, dass der Agaroseblock vollständig mit Krebspuffer bedeckt ist. Um das Vibratom für das Schneiden zu programmieren, stellen Sie die Start- und Stopppositionen ein. Beginnen Sie dann mit dem Schneiden der Scheiben, bis das Leberlappen erreicht ist. Verwenden Sie einen Spatel, um die Leberscheiben zu sammeln, da dies im Gegensatz zu Pinzetten oder Bürsten Schäden vermeidet. Sammeln Sie die Scheiben in eiskaltem Krebspuffer, bis sie für die Kultur bereit sind. Übertragen Sie die Leberscheiben mit einem Spatel in die vorbereiteten Vertiefungen mit dem Medium und den Einsätzen. Legen Sie die Platten dann auf einen auf 130 U/min eingestellten Orbitalschüttler und inkubieren Sie sie in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 21 % Sauerstoff.