Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Kammern

In unserem Labor untersuchen wir den extrazellulären Elektronentransfer (EET) in Bakterien wie Lactiplantibacillus plantarum, einem fermentativen Bakterium, das in der Lebensmittelindustrie von entscheidender Bedeutung ist. Bei der EET überträgt die Zelle Elektronen auf ein extrazelluläres elektronisches Zepter, wie eine Elektrode in einem bioelektrischen chemischen System. Wir wollen EET für Anwendungen in der Biosensorik, Biokatalyse und Lebensmittelfermentation verstehen und entwickeln.

Wir haben herausgefunden, dass der Alpentunnel in Gegenwart von Chinonen wie DHNA Strom über EET kaufen kann. Dieser Prozess regeneriert NAD plus, beschleunigt den Gesamtverlust der primären Fermentationswege und fördert das Zellwachstum. Darüber hinaus stellen wir fest, dass verschiedene Chinonderivate, neben DHNA, auch die EET in L plantarum vermitteln können.

Die Erforschung der vermittelten EET erfordert spezialisierte, biochemische Aufbauten. Konkret verwenden wir ein bioelektrochemisches System mit drei Elektroden und zwei Kammern, um ein Übersprechen zwischen der anodischen und der kathodischen Reaktion zu verhindern. Wir verwenden auch eine Arbeitselektrode mit Kohlenstofffeld, die eine große Oberfläche hat, um den Elektronentransfer von Elektronenmediatoren zu verbessern.

Unsere Arbeit zur Erforschung der EET-Signalwege in L plantarum und wie diese Signalwege mit dem fermentativen Stoffwechsel interagieren, könnte nützliche Anwendungen in der Lebensmittelindustrie haben. Wir wissen, dass EET und L plantarum den Stoffwechselfluss durch Fermentation verändern, und das könnte für nützliche Anwendungen manipuliert werden, um den Geschmack von Lebensmitteln zu verändern und wertvolle Chemikalien in der Elektrofermentation zu produzieren. In Zukunft werden wir unser grundlegendes Wissen über EET weiter ausbauen und neuartige EET-Anwendungen in Organismen wie L. plantarum verfolgen.

Wir planen, Proteine im EET-Signalweg zu entwickeln, die es uns ermöglichen werden, EET für Anwendungen in der Elektrofermentation und Biosensorik weiter zu kontrollieren. Zu Beginn schleifen Sie Titandrähte mit einem Durchmesser von einem Millimeter für die Bearbeitung in Gegenelektroden mit Aluminiumoxid-Schleifpapier vor, bis sie gleichmäßig glänzend sind. Biegen Sie mit einer Zange ein Ende jedes Arbeitselektrodendrahtes zu einem kleinen Haken.

Schieben Sie einen 16 Quadratzentimeter großen Carbonfilz auf jeden funktionierenden Elektrodendraht, weben Sie den Draht einmal in den Carbonfilz ein und aus ihm heraus und ziehen Sie die Runde am Draht herunter, bis er am Haken befestigt ist. Befestigen Sie die Arbeitsbegegnungselektroden in GL 45 Kappen, indem Sie das Gummiseptum mit dem Draht durchstechen und einige Zentimeter durch die Kappe ziehen. Um gepaarte Reaktoren zu bauen, montieren Sie den O-Ring und setzen Sie eine vorgeschnittene Kationenaustauschmembran, die zuvor in Wasser eingeweicht wurde, in den zusammengebauten O-Ring ein.

Platzieren Sie den O-Ring mit der Membran zwischen den großen Bodenöffnungen zweier gepaarter Reaktorflaschen. Befestigen Sie die Reaktorpaarflaschen und einen Ring mit der Membran mit einer Knöchelklemme. Lassen Sie einen magnetischen Rührstab in jede anodische Kammer fallen, bevor Sie alle kleinen Öffnungen an der Oberseite jeder Flasche mit GL14-Kappen verschließen, die mit Gummisepten ausgestattet sind.

Füllen Sie jede Reaktorflasche mit 110 Millilitern entionisiertem Wasser. Setzen Sie die Kappen ein, die mit einer runden Arbeitselektrode aus Carbonfilz versehen sind, und drücken Sie vorsichtig auf die Oberseite der Filzrunde, um sie am Haken zu halten. Verschließen Sie die Flaschen mit dem entsprechenden, mit Elektroden bestückten GL45-Verschluss.

Autoklavieren Sie wassergefüllte Reaktoren und GL14-Elektrodenkappen. Unter sterilen Bedingungen kratzen Sie die Lactoplant-Abasilisk-Plantarum-Kultur von der Oberseite eines Glycerin-Stammes ab und impfen Sie in drei Milliliter kommerzieller Nachfrage Rugosa Sharp oder MRS-Medium. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius, ohne sie zu schütteln.

Entsorgen Sie zunächst in einer sterilen Biosicherheitswerkbank das autoklavierte Wasser aus den Reaktoren des bioelektrochemischen Systems. Füllen Sie die kathodischen Kammern mit 110 Millilitern autoklaviertem M9-Medium und die anodischen Kammern mit 110 Millilitern frisch zubereitetem MCDM. Ersetzen Sie eine GL14-Kappe aus der anodischen Kammer durch eine Autoklav-GL14-Kappe mit einem Silikon-Deckenring.

Besprühen Sie die vorbereiteten Referenzelektroden mit 70 % Ethanol, bevor Sie es durch die Elektrodenkappe in jede anodische Kammer einführen. Ziehen Sie alle Kappen und Klemmen fest, um ein Auslaufen zu vermeiden. Um die Reaktoren an das Wasserpumpensystem anzuschließen, stellen Sie zunächst jeden Reaktor auf die entsprechende Rührstabplattform.

Verbinden Sie dann die Wassermantelstutzen jedes Reaktors mit einem Gummischlauch mit dem nächsten und verbinden Sie die Endreaktoren mit den Zu- und Abflussrohren der Wasserpumpe. Füllen Sie die Pumpe mit Wasser und fügen Sie vier bis sechs Tropfen Wasseraufbereiter hinzu. Schalten Sie das Pumpensystem ein und stellen Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein.

Starten Sie die Pumpe und beobachten Sie, wie das Wasser durch alle Wassermäntel des Reaktors fließt, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind. Schalten Sie die Rührplattformen ein und stellen Sie sie auf Dauerrühren bei 220 U/min ein. Um die Reaktoren an die stickstoffsparenden Gasleitungen anzuschließen, befestigen Sie zunächst einen Luftfilter an einer 22-Gauge-Nadel und führen Sie die Nadel durch das obere Septum einer anodischen Reaktorkammer in das Medium ein.

Führen Sie eine 18-Gauge-Nadel in das obere Septum einer anodischen Reaktorkammer ein, verbinden Sie dann die Gasleitung von einer Stickstoffquelle mit dem Luftfilter und öffnen Sie das Ventil, damit das Gas sanft durch den Reaktor sprudeln kann. Um die Bioreaktoren an die Potentiostatenleitungen anzuschließen, verbinden Sie die Arbeitszähler- und Referenzelektroden-Krokodilklemmenleitungen vom Potentiostaten mit den entsprechenden Elektroden. Nachdem Sie alle Parameter eingegeben haben, drücken Sie das grüne Startdreieck, um den Lauf zu starten.

Beobachten Sie die Leerlaufspannungskurven einige Minuten lang, um sicherzustellen, dass alle Drosseln positiv abgelesen werden. und schließen sich mit einem stetigen Signal. Unter sterilen Bedingungen subkultivieren Sie die zuvor gezüchtete L-Plantarum-Kultur um eins bis 200 in 50 Milliliter MMRS.

Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius, ohne zu schütteln. Nehmen Sie zunächst die in MMRS gezüchtete L-Plantarum-Kultur aus dem Inkubator. Übertragen Sie die Kultur unter sterilen Bedingungen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie das Röhrchen auf Eis.

Zentrifugieren Sie die Kultur bei 4.000 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 50 Millilitern PBS resuspendieren. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die Zellen in kaltem PBS auf eine optische Dichte von 600 Nanometern von 11.

Laden Sie zwei Milliliter resuspendierter Zellen in eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer Nadel versehen ist. Entschließen Sie an der Reaktorstation eine Zellspritze und führen Sie die Nadel in den oberen Teil einer anodischen Kammer des Reaktors ein. Sobald alle Spritzen an Ort und Stelle sind, drücken Sie die Kolben, um die Zellen zu injizieren.

Notieren Sie den Zeitpunkt der Injektion aus der Chronoamperometrie-Spur. Lassen Sie den Strom auf der Leiterbahn zwei bis vier Stunden lang stabilisieren. Markieren Sie im bioelektrochemischen System die Versuchsreaktoren als plus DHNA und die Lösungsmittelkontrollreaktoren als minus DHNA.

Entschließen Sie eine Spritze, die mit 110 Mikrolitern 20 Milligramm DHNA pro Milliliter beladen ist, und führen Sie sie oben in die anodische Kammer ein, die als plus DHNA bezeichnet wird. Führen Sie eine mit 110 Mikrolitern DMSO beladene Spritze in die anodische Kammer ein, die als minus DHNA bezeichnet wird. Entfernen Sie mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgestattet ist, zwei Milliliter Medium aus jeder anodischen Kammer durch das unbenutzte Septum mit kleiner Kappe.

Übertragen Sie die Proben auf eine 24-Deep-Well-Platte, um den pH-Wert für den Null-Stunden-Zeitpunkt zu messen. Drücken Sie die Kolben der DHNA- und DMSO-Spritzen, um in die Reaktoren zu injizieren. Notieren Sie den Zeitpunkt der Injektion aus der Chronoamperometrie-Spur.

Entsorgen Sie alle Spritzen und Nadeln. Entfernen Sie nach 24 Stunden wie zuvor beschrieben zwei Milliliter Medium aus jeder anodischen Kammer und geben Sie es für 24-Stunden-pH-Messungen auf eine 24-Deep-Well-Platte. Führen Sie die zyklische Voltammetrie für den 24-Stunden-Zeitpunkt aus.

Messen und notieren Sie den pH-Wert für die 24-Stunden-Proben aus jedem Reaktor. Die Stromdichte durch extrazellulären Elektronentransfer erreichte acht Stunden nach der DHNA-Injektion einen Spitzenwert von etwa 132 Mikroampere pro Quadratzentimeter. Im Gegensatz dazu führte die DMSO-Einspeisung zu einer vernachlässigbaren Stromdichte.

Die zyklischen Voltammetrie-Daten zeigten einen deutlichen Anstieg des oxidativen Stroms bei 50 Millivolt in Gegenwart von L-Plantarum mit DHNA im Vergleich zu L-Plantarum mit DMSO und einen Anstieg der Stromdichte um 256 % bei 300 Millivolt im Vergleich zur abiotischen DHNA-Spur. Der extrazelluläre Elektronentransfer führte zu einem bemerkenswerten Abfall des pH-Werts auf durchschnittlich 3,33 über 24 Stunden in den Proben mit L plantarum und DHNA, während die Proben mit L plantarum und DMSO einen durchschnittlichen pH-Wert von 6,50 aufwiesen.