Name: Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Lernen Sie die Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Diese Methode nutzt TIRF-Mikroskopie und fluoreszenzmarkierte Proteine, um Replikationsdynamiken in Drosophila melanogaster zu untersuchen.

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<meta charset="utf8"></head><body>CMG-vermittelte DNA-Dewindung durch Wachstum des ssDNA-RPA-Trakts beobachtet

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
<li>Jones, M. L., Baris, Y., Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+human+replisome+shows+the+organisation+and+interactions+of+a+DNA+replication+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a human replisome shows the organisation and interactions of a DNA replication machine.</a> EMBO J. 40 (23), e108819(2021).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Baris, Y., Taylor, M. R. G., Aria, V., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+DNA+replication+with+purified+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient DNA replication with purified human proteins.</a> Nature. 606, 204-210 (2022).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid / Bis-Lösung 40%&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Verwendet zur Herstellung von Tris-Puffern (pH 8)</td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>Verwendet mit Fraktionssammler F9-C; Proteinreinigungssystem</td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2-Affinitätsgel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Deckfolie</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wie beschrieben vorbereitet: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>Biotinylierter Anti-Digoxigenin-Antikörper&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>N/A</td><td>Klebekitt</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA; 33 mg/mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3858-10G</td><td>Verdünnt aus dem Schaft</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>Cytiva</td><td>29275878</td><td>Verbunden mit dem AKTA-Protein-Reinigungssystem; Hochauflösende Ionenaustauschchromatographie-Säule</td></tr><tr><td>Kasein (5 % im Wasser, 50 mg/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc-System</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clips</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Schneidebrett</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch (3,5 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-dUTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Ladefarbe 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband (0,14 mm dick)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluorochem Limited</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK-Peptid&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Synthetisiert durch chemische Biologie STP des Francis Crick Institute</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gereinigt, wie in ' Single Molecule Analysis', Series Methods in Molecular Biology, Bd. 783 (2011), Peterman, E. J. G. und Wuite G. J. L. herausgeber, Humana Press. Proteininformation: 2 mM, menschlich, exprimiert in E. coli.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidharz – 5 Minuten</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5000&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>&nbsp; FLA-5000&nbsp;</td><td>Fluoreszierender Bildanalysator</td></tr><tr><td>GelRed Nukleinsäurefärbung; 10000x</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>41003-BT</td><td>Beispiel für Nukleinsäurefärbe, die eine sicherere Alternative zu Ethidiumbromid darstellt.</td></tr><tr><td>Glas- oder Quarzrutsche mit Löchern für Rohre;</td><td>Dremel Modell 395</td><td></td><td>1 mm dicker Schlitten, auf 2,4 cm x 1 cm zugeschnitten, zwei Löcher im Abstand von 1,4 mm gebohrt. Die Löcher sollten in unterschiedlichen Größen gebohrt werden, um an jedem Ende unterschiedliche Rohre aufzunehmen.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>Glycin HCl, pH 3,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-Spritze, 1000er-Serie GASTIGHT, PTFE-Luer-Schloss 1010TLL, PTFE-Luer-Schloss (mit Schlitzen), Volumen 10 mL</td><td>Merck</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-CeuI</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>Maxi GeBaFlex-Dialysekit; MWCO 14 kDa&nbsp;</td><td>Generon</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>Metallpfannenwender</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metallpinzette</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP (Spritzenfilter) 0,22 & micro; m&nbsp;</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nadel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4%&ndash; 12 % Bis-Tris Proteingele</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Zielheizer</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Mischung – 2x</td><td></td><td></td><td>Hergestellt aus Phusion-DNA-Polymerase (20 & Mikro; L), 10 mM dNTPs (40 & Mikro; L), 5x Phusion HF-Puffer (400 & Mikro; L) und Wasser (540 & Mikro; L).</td></tr><tr><td>Peptid NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, gekennzeichnet mit LD655-MAL&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Peptid NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, mit LD655-MAL (Lumidyne Technologies) auf dem Cysteinrest gekennzeichnet, wurde vom Peptidchemie-STP des Francis Crick Institute synthetisiert und gereinigt</td></tr><tr><td>pGC261-Plasmid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffpinzetten</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenrohr PE20 (Innendurchmesser 0,015", Außendurchmesser 0,043")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenrohr PE60 (Innendurchmesser 0,03", Außendurchmesser 0,048")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep-Chromatographie-Säulen; 10 ml und 20 ml&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumglutamat (L-Glutaminsäure Kaliumsalzmonohydrat)</td><td>Sigma</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail (cOmplete, frei von EDTA)</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Pump 11 Elite Infusion/Entzugsprogrammierbare Einzelspritze</td><td>Harvard-Apparat</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Reinigungskit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>VWR International Ltd</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart-Puffer; 10x</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Sortase (Pentamutant)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gereinigt basierend auf: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>Spin-X Zentrifugenröhrenfilter; 0,22 &mikro; M-Celluloseacetat&NBSP;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Skalpell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Vakuumbetriebenes Einwegfiltersystem; 0,22 ähm; PES; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (1 mg/mL) in 1x PBS-Puffer</td><td>Sigma</td><td>S4762-10MG</td><td>20 & Mikro; L-Aliquotes</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Eine hochempfindliche Nukleinsäurefärbung, die wir verwendeten, um das DNA-Gabelsubstrat zu visualisieren.</td></tr><tr><td>SYTOX orange; 5 & Mikro; M in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEV-Protease (1 mg/mL); EZCut&nbsp;</td><td>Biovision</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>Gewebeschleifer, Dounce-Typ (40 ml, Wheaton)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Verwendet zur Herstellung von Tris-Puffern (pH 8)</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega UK Ltd</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

einzelmolekül-echtzeit-visualisierung der dna-abwicklung durch cmg-helikase

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

single-molecule-real-time-visualization-dna-unwinding-cmg

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

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Echtzeit-Beobachtung der DNA-Strang Exchange Reaktion vermittelt durch Rad51

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Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

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