Name: Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Erfahren Sie die computergestützte Quantifizierung von Augenphänotypen bei Drosophila melanogaster mit Ilastik und Flynotyper. Diese Methode reduziert Verzerrungen manueller Bewertungen und ermöglicht präzisere Analysen neurodegenerativer Krankheitsmodelle.

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<meta charset="utf8"></head><body>Unverzerrte Quantifizierung von Ommatidien in Drosophila-Augenmodellen

<ol><li>Iyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+eye+phenotypes+for+functional+genetic+studies+using+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).</li>
<li>Thomas, B. J., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fly%27s+eye+view+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A fly's eye view of biology.</a> Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).</li>
<li>Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+representation+of+loss+of+eye+regularity+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+Drosophila+reveals+the+conserved+role+of+REEP1+in+promoting+stress+resistance+and+preventing+the+formation+of+Tau+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates.</a> Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).</li>
<li>Pandey, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+rescues+neurodegeneration+and+provides+an+essential+link+between+autophagy+and+the+UPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS.</a> Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).</li>
<li>Outa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Drosophila+model+of+wild-type+and+T315I+mutated+BCR-ABL1+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+an+effective+platform+for+treatment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening.</a> Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).</li>
<li>Shirinian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Drosophila+melanogaster+model+to+study+human+T-lymphotropic+virus+oncoprotein+Tax-1-driven+transformation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo.</a> J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+image+analysis+method+to+measure+regularity+in+biological+patterns%3A+a+case+study+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Yusuff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+pathogenic+copy-number+variant+genes+show+global+and+non-neuronal+defects+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development.</a> PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).</li>
<li>Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eip74EF+is+a+dominant+modifier+for+ALS-FTD-linked+VCPR152H+phenotypes+in+the+Drosophila+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).</li>
<li>Baek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+PINK1+mediate+CHCHD10S59L+mutation-induced+defects+in+Drosophila+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro.</a> Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ryzen</td><td></td><td></td><td>5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10</td></tr><tr><td>Flynotyper</td><td>Iyer, J. et al. (2016)</td><td>Software hier herunterladen: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html Open-Source-Software</td><td>. Verwenden Sie Flynotyper 2.0 nicht. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung war 2.0 noch recht neu und dieses Protokoll ist für die ursprüngliche Version von Flynotyper optimiert.</td></tr><tr><td>ilastik</td><td>Berg, S. et al. (2019)</td><td>Software hier herunterladen: https://www.ilastik.org/download.html Open-Source-Software</td><td>. Laden Sie Version 1.4.0.post1 unter Reguläre Builds herunter, die dem Betriebssystem Ihres Computers entsprechen.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>Laden Sie die Software hier herunter: https://imagej.net/ij/download.html Open-Source-Software</td><td>. Zum Einsatz kamen die Versionen 1.53 und 1.54. 1.54 ist die aktualisierte Version und der Standard-Download.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LASX Office 1.4.6 28433</td><td>System und Software für die Erfassung von Z-Stacks.</td></tr><tr><td>Leica Z16 APO-Mikroskop mit DMC2900 Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 447 173, 12 730 466</td><td>Im Text als Z-Stapel-Mikroskop und Kamera bezeichnet. Dieses Produkt ist jetzt archiviert.</td></tr></tbody></table>

quantifizierung von drosophila melanogaster augenphänotypen: ein computergestützter ansatz zur integration von ilastik und flynotyper

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

In einer früheren Studie haben wir dieses Protokoll verwendet, um genetische Modifikatoren des mutierten VCP-Proteins zu bestimmen, das mit amyotropher Lateralsklerose mit frontotemporaler Demenz (ALS-FTD) in Verbindung gebracht wird12. Darüber hinaus wurde diese Methode auch in einer anderen Arbeit verwendet, um die Toxizität von CHCHD10S59L-vermittelten ALS-FTD zu bewerten, selbst wenn ein älteres Stereomikroskopverwendet wurde 13. Um diese Ergebnisse weiter zu validieren, verwendeten wir Ilastik und Flynotyper in der gleichen ALS-FTD-Krankheitsmutation wie Baek et al.13; Ein nicht geschultes Laborpersonal führte das Experiment jedoch durch und erzielte ähnliche Ergebnisse. Daher ist die Kombination von Ilastik und Flynotyper eine robuste Methode, um die Degeneration der Drosophila-Ommatidien unvoreingenommen zu bewerten.
Wir bevorzugen die Verwendung eines Ringlichts, da es eine bessere qualitative Bewertung ermöglicht (Abbildung 3). Die Verwendung eines Ringlichts verursacht jedoch einen Schatten, den Flynotyper nicht direkt analysieren kann. Um dies zu umgehen, haben wir die Bilder in ilastik vorbearbeitet, bevor wir die P-Scores mit Flynotyper quantifiziert haben. Insgesamt waren die P-Scores des nicht degenerierten (GMR-GAL4) Fliegenauges signifikant niedriger als bei einem mäßig degenerierten Auge (2x_S81L) und einem stark degenerierten Auge (3x_S81L) (Abbildung 4A,B und Tabelle 1). Dies ist das erwartete Ergebnis, da höhere P-Scores, die von Flynotyper generiert werden, auf ein stärker degeneriertes Augehinweisen 1. Wenn Ilastik nicht verwendet wurde, gab es vernachlässigbare Unterschiede in den P-Werten zwischen einem nicht degenerierten Auge und einem mäßig degenerierten Auge (Abbildung 4C und Tabelle 1). Dies deutet darauf hin, dass Flynotyper Schwierigkeiten hat, Ommatidienmuster unter Ringlichtbedingungen ohne den Einsatz von Ilastik genau zu identifizieren. Dies liegt daran, dass Flynotyper so konzipiert ist, dass Bilder verwendet werden, die mit einem Dual-Point-Licht aufgenommen wurden, das mit zusätzlichen Anpassungen in Graustufen umgewandelt wird, um das ommatatidiale Zentrum1 zu identifizieren. Ilastik repliziert diesen Prozess, indem es einen Punkt in die Mitte jedes Ommatidiums einbaut, was eine Quantifizierung innerhalb von Flynotyper ermöglicht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig01.jpg"> Abbildung 1: Beispiel für einen ilastik-Workflow. (A) Erstellen eines neuen Projekts in ilastik. (B) Auswahl des Standardbildes. (C) Auswahl von Sigma-Werten unter Feature-Auswahl. (D) Markierung des Vordergrunds von Ommatidien für die Empfindlichkeit. (E) Markierung des Hintergrunds von Ommatidien für die Empfindlichkeit. (F) Auswählen, wie die Software verarbeitete Dateien exportieren soll. (G) Auswahl der experimentellen Fliegenaugenbilder, die analysiert werden sollen. (H) Zeigen, welche experimentellen Fliegenaugenbilder analysiert werden. (I) Fertiges Produkt nach dem Ausführen der Software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für einen Flynotyper-Workflow. (A) Nur das Auge der Fliege für die weitere Analyse auswählen. (B) Öffnen des abgeschnittenen Augenbildes in einem neuen Fenster. (C) Auswahl der zu analysierenden Schnittbilder und der Parameter, die für die Analyse überprüft werden sollen. (D) Beispielhafte Ergebnisse. Phänotypische Werte werden ganz rechts dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig03.jpg"> Abbildung 3: Qualitative Drosophila-Augenbilder . Dasselbe Fliegenauge, aufgenommen mit einem Ringlicht (links) und aufgenommen mit einem Doppelpunktlicht (rechts) unter nicht entarteten (oben) und degenerierten (unten) Bedingungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig04.jpg"> Abbildung 4: Verwendung von Ilastik vor Flynotyper zur genauen Quantifizierung des Phänotyps des rauen Auges bei Drosophila. (A) Repräsentative Drosophila-Augenbilder eines nicht degenerierten Auges (GMR-GAL4), eines mäßig degenerierten Auges (2x_S81L) und eines schwer degenerierten Auges (3x_S81L). (B) Die Quantifizierung erfolgt durch Flynotyper nach Anwendung von ilastik. Die p-Werte eines zweiseitigen Permutations-t-Tests wurden berechnet, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern (GMR-GAL4 vs. 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs. 3x_S81L: p = 0) (C) Quantifizierungsergebnisse von Flynotyper ohne Verwendung von Ilastik. Die p-Werte eines zweiseitigen Permutations-t-Tests wurden berechnet, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern (GMR-GAL4 vs. 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs. 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 für jede Gruppe. Datenpunkte werden auf der X-Achse verwackelt oder gestapelt, um die visuelle Übersichtlichkeit zu gewährleisten. Die durchgezogene horizontale Linie stellt den Durchschnitt dar. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">GMR-GAL4</td>
			<td colspan="2">2x_S81L</td>
			<td colspan="2">3x_S81L</td>
		</tr><tr><td>Mit ilastik</td>
			<td>Ohne Ilastik</td>
			<td>Mit ilastik</td>
			<td>Ohne Ilastik</td>
			<td>Mit ilastik</td>
			<td>Ohne Ilastik</td>
		</tr><tr><td>26.7</td>
			<td>55.7</td>
			<td>52.5</td>
			<td>51.2</td>
			<td>59.9</td>
			<td>55.6</td>
		</tr><tr><td>17.4</td>
			<td>53.5</td>
			<td>50</td>
			<td>54.9</td>
			<td>60.7</td>
			<td>52</td>
		</tr><tr><td>22.8</td>
			<td>55.5</td>
			<td>56.8</td>
			<td>55.2</td>
			<td>60.1</td>
			<td>55.1</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: P-Scores bei Verwendung von Flynotyper mit Ilastik und bei alleiniger Verwendung von Flynotyper. 
Ergänzende Abbildung S1: Fliegenkopfhalterung für die Bildaufnahme eingerichtet. Dies ist ein Beispiel für die Einrichtung der Bildaufnahme mit mehreren Blättern Papier. Es kann jedoch jede Methode verwendet werden, die die richtige Ausrichtung des Kopfes und des Fliegenauges gewährleistet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: Quantitative Ergebnisse von ilastik und Flynotyper bei Verwendung eines Sigma-Wertes von 2,5 unter Merkmalsauswahl. Die Verwendung eines anderen Sigma-Werts als 5,0 bei der Merkmalsauswahl in Ilastik kann zu einer ungenauen Quantifizierung führen. Konkret führt ein Sigma-Wert von 2,5 zu einem Verlust der Empfindlichkeit. Die p-Werte eines zweiseitigen Permutations-t-Tests wurden berechnet, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern (GMR-GAL4 vs. 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs. 3x_S81L: p = 0). N = 3 für jede Gruppe. Datenpunkte werden auf der X-Achse verwackelt oder gestapelt, um die visuelle Übersichtlichkeit zu gewährleisten. Die durchgezogene horizontale Linie stellt den Durchschnitt dar. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%202.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S3: Verlust der Sensitivität und ungenaue P-Scores aufgrund nekrotischer Flecken. Weiße Pfeile zeigen auf Segmente nekrotischer Flecken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%203.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle S1: P-Scores bei Verwendung eines Sigma-Wertes von 2,5 unter Merkmalsauswahl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219_Supp%20Table%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

quantifying-drosophila-melanogaster-eye-phenotypes-computational

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Vorbereitung von Adult Drosophila Augen für Thin Schnitte und mikroskopische Untersuchung

Quelle: Wagner, K. et al., Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen. J. Vis. exp. (2022). Dieses Video zeigt die Visualisierung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten TRPL-Proteinen. Es beschreibt die Vorbereitung transgener Fliegen für die Bildgebung, die Aufnahme von Fluoreszenzbildern von Photorezeptorzellen und die Quantifizierung des TRPL-Transports...

Untersuchung des Transports von Membranproteinen in Drosophila-Photorezeptorzellen

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Die Insel-Assay ist ein relativ neuer, kostengünstiger Assay, der verwendet werden, um der Bewegungsorgane Grundverhalten von Drosophila Melanogasterzu bewerten. Dieses Manuskript beschreibt Algorithmen für die automatische Datenverarbeitung und objektive Quantifizierung der Insel Assay Daten, so dass dies eine sensible, Hochdurchsatz-Auslesen für große genetische oder pharmakologische Bildschirme assay.

Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay

Protokolle für die Inszenierung pupal Perioden und Messung der Flügel Pigmentierung der Drosophila Guttifera werden beschrieben. Inszenierung und Quantifizierung der Pigmentierung bieten eine solide Grundlage für das Studium Entwicklungsmechanismen von Erwachsenen Züge und interspezifischen Vergleich der Eigenschaft Entwicklung ermöglichen.

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Dieses Protokoll beschreibt einen in-vivo Phagozytose Assay in Erwachsenen Drosophila Melanogaster , Phagozyten Anerkennung und Räumung von mikrobiellen Infektionen zu quantifizieren.

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Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

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