Quantifizierung von Diabetes-induzierten adhärenten Leukozyten im retinalen Gefäßsystem

Der Schwerpunkt der Forschung in unserem Labor liegt darauf, zu erfahren, was die Retinopathie bei Diabetes verursacht und wie sie verhindert werden kann. Mehrere Laboratorien haben gezeigt, dass die Leukostase, die Überansammlung von weißen Blutkörperchen, in den kleinen Gefäßen des Auges Diabetes erhöht. Und das könnte zum Verschluss und zur Degeneration der Gefäße in der Netzhaut bei Diabetes beitragen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung des Schweregrads der Leukostase im retinalen Gefäßsystem. Und es kann in Studien verwendet werden, die die Wirksamkeit verschiedener Therapien, einschließlich Medikamente, bewerten wollen.

[Dozent] Um den Drucksieb einzurichten, schließen Sie den 0,9%igen Kochsalzbeutel in Reihe an. das intravenöse Katheterset, ein Vierwege-Absperrhahnventil und die Sondennadel. Öffnen Sie das Perfusionssystem und spülen Sie die Leitungen und Anschlüsse zwei Minuten lang mit Kochsalzlösung bei einer Durchflussrate von 18 bis 20 Millilitern pro Minute, um eventuelle Luftblasen zu entfernen. Legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf die Perfusionsstufe. Identifizieren Sie den Xiphoid-Prozess visuell. Mit dem Blutstiller in der dominanten Hand sichern und fixieren Sie die Haut. Übertragen Sie dann das Blutstillungsmittel auf die nicht dominante Hand und heben Sie die Haut an. Schneiden Sie anschließend mit einer Schere ein Stück Haut in einem 90-Grad-Winkel zur Wirbelsäule ab, um die äußere Bauchdecke freizulegen. Wenn der Xiphoid-Prozess und der Brustkorb sichtbar sind, präparieren Sie beidseitig durch die Bauchdecke und vermeiden Sie vorsichtig alle Organe oder größeren Gefäße. Stellen Sie sich nun die Herzventrikel und die Lunge durch das Zwerchfell vor. Machen Sie mit der Scherenspitze auf einer Seite in der Nähe der Wirbelsäule einen Schnitt in das Zwerchfell. Legen Sie das Herz in der Brusthöhle frei, nachdem Sie das Brustbein halbiert haben. Fassen Sie mit der Pinzette in der nicht dominanten Hand das Herz in der Nähe seiner Spitze. Halten Sie mit der dominanten Hand die Sondennadel am intravenösen Katheter fest und punktieren Sie die Herzspitze. Stellen Sie sicher, dass die Kugelspitze der Sondennadel leicht aus der Einstichstelle herausragt, um eine vollständige Perforation des linken Ventrikels oder einen Eintritt in das Lungengefäßsystem zu vermeiden. Öffnen Sie anschließend den Absperrhahn, um den Durchfluss von 0,9 % Kochsalzlösung zu ermöglichen. Schneiden Sie gleichzeitig mit einer Schere das rechte Atrium auf. Setzen Sie die Perfusion zwei bis drei Minuten lang fort und bewegen Sie die Nadel sanft von einer Seite zur anderen und auf und ab, um ein Abknicken der Gefäße zu verhindern und den Blutabfluss aus dem Herzen zu erhöhen. Drehen Sie nach der Perfusion den Absperrhahngriff, um den Kochsalzfluss zu unterbrechen und den Fluss von der Spritze zur Sondennadel zu ermöglichen. Dann perfundierte manuell 10 Milliliter Concanavallin A-Lösung innerhalb von 30 bis 35 Sekunden. Nachdem Sie das Herz einer anästhesierten Maus mit Concanavallin A-Lösung durchblutet haben, drehen Sie die Maus auf die Seite. Lege den Zeigefinger der nicht-dominanten Hand auf das obere Augenlid und den Daumen auf das untere Augenlid. Ziehen Sie die Augenlider und die umgebende Haut vorsichtig zurück, um das Auge zu stützen, damit es sich teilweise aus der Augenhöhle auswölben kann. Als nächstes schaufeln Sie mit der gebogenen Schere in der dominanten Hand in einem 45-Grad-Winkel unter das Auge. Schneiden Sie die Muskelansätze und den Sehnerv ab. Übertragen Sie das Auge mit der Schere als Spatel in ein kleines Gefäß. Legen Sie das Auge auf Zahnwachs, um die Öffnung des Globus vorzubereiten. Halten Sie unter dem Präpariermikroskop mit einer Mikrozange die Skleralfalte oder Muskelreste am hinteren Teil des Auges fest und richten Sie das Auge so aus, dass die Hornhaut zur Seite zeigt. Machen Sie einen Schnitt hinter und parallel zum Limbus. Trennen Sie den vorderen Augenabschnitt mit einer Mikroschere, einschließlich der Linse um den Umfang der Augenmuschel, und stellen Sie sicher, dass die Netzhaut vollständig von der Sklera gelöst ist. Schöpfen Sie die Netzhaut mit dem Mikrospatel aus der Sklera heraus. Wenn die Netzhaut noch durch den Sehnerv verbunden ist, führen Sie eine Mikroschere zwischen Netzhaut und Sklera ein, um den Sehnerv zu durchtrennen. Platzieren Sie die nicht fixierte Netzhaut mit einem Tropfen PBS auf einem Objektträger. Machen Sie vier bis fünf radiale Schnitte in die Netzhaut, so dass ein Kleeblattmuster entsteht, so dass es flach aufliegt. Betrachten Sie die flach montierte Netzhaut unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung mit einem 10-fachen Objektiv. Die Fluoreszenzmikroskopie des retinalen Gefäßsystems zeigte, dass diabetische Netzhäute eine leichte Leukostase mit typischerweise 3 bis 12 Leukozyten pro Netzhaut aufwiesen, verglichen mit 1 bis 3 bei nichtdiabetischen Kontrollen. Signifikante Leukozytencluster wurden in Lipopolysaccharid-provozierten Entzündungsmodellen beobachtet, im Gegensatz zu dem milden Clustering in diabetischen Proben.