Skalierbarer Biomanufacturing-Workflow zur Herstellung und Isolierung von natürlichen, aus Killerzellen gewonnenen extrazellulären Krebs-Biotherapeutika auf Vesikelbasis

Unsere Forschung konzentriert sich auf kleine Vesikel, die von einer Art von Immunzellen produziert werden, die auf natürliche Weise Krebszellen abtöten. Diese Vesikel bergen ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial für die Behandlung solider Tumore, sowohl an den primären als auch an sekundären Stellen wie dem Gehirn. In dieser Studie verwenden wir ein bimodales Harz, um Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie zu isolieren und die Produktreinheit zu maximieren, indem die Vesikel physikalisch von Verunreinigungen getrennt werden, während Verunreinigungen durch elektrostatische Kräfte weiter im Harz eingefangen werden.

Anschließend sterilisieren, konzentrieren und puffern wir die Vesikel vor der Verwendung. Der in diesem Video beschriebene Biomanufacturing-Workflow verwendet klinisch relevante Bedingungen und ist kostengünstig skalierbar, wodurch große Mengen hochreiner extrazellulärer Vesikel effektiv hergestellt werden. Dies macht die Technik für akademische Labore zugänglich, um selbstbewusst Ressourcen in die Erforschung solcher Therapeutika mit einem zuverlässigen Produktions- und Isolierungsprozess zu investieren. Wir untersuchen derzeit das therapeutische Potenzial dieser Vesikel und präklinischen Modelle und vertiefen unser Verständnis ihrer Wirkungsweise.

Führen Sie zunächst eine schnelle Inbetriebnahme des Proteinflüssigkeitschromatographiesystems gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Stellen Sie Verbindungen mit der Tropf-zu-Tropf-Methode her, um sicherzustellen, dass keine Luft in die Säule gelangt. Richten Sie den Fraktionssammler mit geeigneten Sammelröhrchen ein, um die Proben zu entnehmen.

Ändern Sie die Fraktionierungseinstellungen auf das gewünschte Auffangvolumen. Nehmen Sie 40 bis 80 Milliliter zuvor vorbereiteter extrazellulärer Vesikel oder EV-reicher konditionierter Medien aus dem 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen Sie sie schnell bei 37 Grad Celsius auf. Die Probe wird bei 10.000 g 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius geschleudert und der Überstand in ein neues Röhrchen umgefüllt.

Um den Gehalt an doppelsträngiger DNA zu reduzieren, behandeln Sie das EV-reiche konditionierte Medium mit fünf Millimol Magnesiumchlorid und 50 Einheiten pro Milliliter Endonuklease. Inkubieren Sie die Probe zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und mäßiger Durchmischung. Sobald das Chromatographiesystem bereit ist, laden Sie das EV-reiche konditionierte Medium in eine 60-Milliliter-Spritze und schließen Sie sie an die Probenleitung an.

Klicken Sie auf Manueller Lauf, um das System zu starten und die Durchflussrate auf Null zu setzen. Befolgen Sie die Anweisungen der Software, um die Ausführung präventiv zu speichern. Klicken Sie dann auf Start.

Wählen Sie Line Beat Double-Filtered PBS und laufen Sie mit einer Strömungsgeschwindigkeit von zwei Millilitern pro Minute, um sicherzustellen, dass die Lösung durch die Säule läuft. Sobald sich das Absorptionsmittel stabilisiert hat, drücken Sie Auto Zero UV. Ändern Sie den Durchflussweg, um die Probe in die Abfallflasche vor der Säule zu leiten. Leiten Sie die Probe nach fünf bis 20 Sekunden auf die Säule.

Sobald die UV-Messwerte etwa 230 Milliabsorptionseinheiten erreichen, klicken Sie auf Fraktionierung. Nach vollständiger Injektion der Probe stellen Sie das Puffersystem auf doppelt gefiltertes PBS um, um die Aufreinigung fortzusetzen. Wenn der UV-Wert etwa 1.600 Milliabsorptionseinheiten erreicht, klicken Sie erneut auf Fraktionierung.

Sobald der Lauf gestoppt wurde, speichern Sie das Chromatogramm als PDF-Dokument. Spülen Sie jede Komponente des Ultrafiltrationsgeräts mit 20 bis 30 Millilitern 90%igem Ethanol. Bei 4.000 g fünf bis 10 Minuten schleudern und den Durchfluss wegwerfen.

Führen Sie dann die Spülung mit sterilem PBS durch, um das Gerät auszugleichen und die Zentrifugationsschritte wie zuvor zu wiederholen. Kombinieren Sie alle verdünnten Fraktionen von NK-EVs. Um die Sterilität zu maximieren, filtrieren Sie die verdünnte NK-EV-Lösung mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter, der mit doppelt gefiltertem PBS vorbefeuchtet wird.

Das Filtrat wird in die sterilisierte Konzentrationsapparatur eingebracht. Schleudern Sie das Filtrat 15 bis 40 Minuten lang bei 4.000 g. Nach dem Schleudern die Lösung im oberen Filterfach mit einer serologischen Pipette mischen.

Auch hier bei 4.000 g für 10 Minuten drehen. Drehen Sie die Filtervorrichtung um und befestigen Sie sie an der Auffangvorrichtung, um den NK-EV aufzufangen. Schleudern Sie den NK-EV zwei Minuten lang bei 2.000 g und geben Sie das gereinigte Produkt in ein steriles Röhrchen.

Starten Sie das Nanopartikel-Tracking-Analysesystem gemäß den Anweisungen des Herstellers. Beobachten Sie die Durchflusszelle auf Luftblasen. Wenn eine Luftblase vorhanden ist, entfernen Sie diese, indem Sie die Durchflusszelle mit 20 % Ethanol und doppelt gefiltertem Wasser spülen.

Sobald es klar ist, setzen Sie das Lasermodul vorsichtig wieder in das Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument ein. Schließen Sie die Klappe und klicken Sie auf Kamera starten. Ändern Sie die Aufnahmeeinstellungen auf eine Bildschirmverstärkung von zwei und eine Kamerastufe von 14.

Schalten Sie die Heizung ein, um die Temperatur der Durchflusszelle zu stabilisieren. Klicken Sie auf Standardmessung, um auf der Registerkarte SOP ein Skript für die Erfassung einer Erfassung über eine Minute bei einer Durchflussrate von 30 bei 23 Grad Celsius zu erstellen. Fügen Sie den Ordner- und Dateinamen zum Pfadnamen hinzu, um die Daten zu speichern.

Reinigen Sie das gereinigte NK-EV-Produkt und bereiten Sie die Verdünnung mit doppelt filtriertem PBS vor. Nachdem Sie die verdünnte Probe vortext haben, laden Sie sie in die 1-Milliliter-Erfassungsspritze, ohne Luftblasen einzuführen. Schließen Sie die Spritze vorsichtig an die Instrumentenladeleitung an.

Drücken Sie langsam die Hälfte der Probe und lassen Sie etwa 0,5 Milliliter in der Spritze. Sobald die Partikel auf dem Bildschirm sichtbar sind, fokussieren Sie die Kamera so, dass maximal ein Halo um jedes Partikel herum vorhanden ist. Klicken Sie auf der Registerkarte Hardware auf Infusion und stellen Sie eine Rate von 1.000 für fünf Sekunden ein. Senken Sie dann die Rate auf 30.

Drücken Sie auf Skript ausführen. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Einstellungen korrekt sind, klicken Sie auf Ja und befolgen Sie die Anweisungen der Software. Klicken Sie nach Abschluss der Erfassung auf Abbrechen, wenn die Software Sie auffordert, Dateien zu verarbeiten oder zu exportieren.

Wenn Sie fünf Erfassungen pro Verdünnung aufzeichnen, importieren Sie alle fünf Erfassungen für die Analyse. Markieren Sie die Dateien und klicken Sie auf Ausgewählte Dateien verarbeiten. Passen Sie auf der Registerkarte Prozess die Analyseeinstellungen auf eine Bildschirmverstärkung von zwei und einen Erkennungsschwellenwert von 15 an.

Aktivieren Sie diese Option und klicken Sie auf OK für die Analyse. Klicken Sie nach der Verarbeitung auf Ja, ohne auf weitere Felder zu klicken, oder klicken Sie auf Exportieren, um die Dateien zu exportieren. Die gereinigte NK-EV-Partikelgröße reichte von 76,30 bis 174,30 Nanometern mit einer durchschnittlichen Konzentration von 1,39 mal 10 bis zu einer Leistung von 12 EVs pro Milliliter.

Zusätzlich zeigte die Fluorometer-Quantifizierung eine Proteinkonzentration von etwa 300 Milligramm pro Milliliter und eine doppelsträngige DNA-Konzentration von 225 Milligramm pro Milliliter. Die Behandlung mit humanen K562-Leukämiezellen mit NK-EVs zeigte eine dosisabhängige Abnahme der Zellviabilität mit einem EC 50 von 9,33 mal 10 hoch neun EVs pro Milliliter.