Name: Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Zellsortiertechnologie hochreine extrazelluläre Vesikel aus mesenchymalen Stromazellen isolieren. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der Vesikel und ermöglicht die Identifikation seltener Populationen für die Geweberegeneration.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszenzbasierte Sortierung von extrazellulären Vesikeln aus Fettgewebe

<ol><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-specific+regulation+of+extracellular+vesicle+biogenesis+and+cargo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).</li>
<li>Witwer, K. W., Wolfram, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+versus+synthetic+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).</li>
<li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).</li>
<li>Du, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+A+rising+star+for+therapeutics+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+and+other+tissues%3A+Basic+biological+properties+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications.</a> Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).</li>
<li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Toward+cell-free+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications.</a> Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).</li>
<li>Galipeau, J., Sensébé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+Clinical+challenges+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+cells+of+the+same+size%2C+shape%2C+and+cell+cycle+stage+for+a+single+cell+level+assay+without+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining.</a> BMC Cell Biol. 7, 25(2006).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+detection+and+sorting+of+nanoscale+vesicles+in+viral+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer.</a> J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).</li>
<li>Andreu, Z., Yanez-Mo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanins+in+extracellular+vesicle+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function.</a> Front Immunol. 5, 442(2014).</li>
<li>Mildmay-White, A., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+on+adipose-derived+stem+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).</li>
<li>Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+The+next+chapter+in+the+reporting+and+reliability+of+single+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).</li>
<li>Maia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+flow+cytometry+to+extracellular+vesicles+sample+microvolume+analysis+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>5(6)-Carboxyfluoresceindiacetat&nbsp; N-Succinimidylester</td><td>Merck</td><td>150347-59-4</td><td></td></tr><tr><td>Fett-mesenchymale Stromazellen</td><td>Wepredic, Geschäftsträger, 35760 Saint-Gr&eacute; goire, Frankreich</td><td></td><td>In dieser Studie verwendete Zellen</td></tr><tr><td>Alexa 488 anti-Caveolin</td><td>R& D Systems</td><td>IC5736G</td><td>Durchflusszytometrie Antikörper</td></tr><tr><td>APC anti-human CD44</td><td>BioLegend</td><td>338805</td><td>Durchflusszytometrie Antikörper</td></tr><tr><td>APC anti-human CD63</td><td>BioLegend</td><td>353007</td><td>Durchflusszytometrie Antikörper</td></tr><tr><td>APC anti-human CD81 (TAPA-1)</td><td>BioLegend</td><td>349509</td><td>Durchflusszytometrie Antikörper</td></tr><tr><td>APC anti-human CD9</td><td>BioLegend</td><td>312107</td><td>Durchflusszytometrie Antikörper</td></tr><tr><td>BC CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>BC CytoFLEX S ausgestattet mit 3 Lasern, Blau, Rot und Violett</td></tr><tr><td>Flow-Check Pro Fluorosphären</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td>Fluoreszierende Kontrollkügelchen für MoFLO Astrios EQ</td></tr><tr><td>FlowJo Software (Version 10.8.1)</td><td>BD</td><td>Version 10.8.1</td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>IntraSure Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>641776</td><td>Fixierung und Permeabilisierung für die intrazelluläre Färbung</td></tr><tr><td>Megamix-Plus FSC</td><td>BioCytex</td><td>7802</td><td>FSC Polystyrolkügelchen&nbsp;</td></tr><tr><td>MoFLO Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>MoFLO Astrios EQ ausgestattet mit 4 Lasern, Blau, Gelb - Grün, Violett und Rot</td></tr><tr><td>Maus Anti-FLOT1 Antikörper</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610820</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Antikörper NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Calnexin Antikörper</td><td>Origene</td><td>TA336279</td><td>Western Blot</td></tr> <tr><td>AntikörperKaninchen-Anti-CD9- und CD81-Antikörper (ExoAb-Antikörper-Kit)</td><td>System Biosciences</td><td>EXOAB-KIT-1</td><td>Western-Blot-Antikörper</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-TSG101-Antikörper</td><td>Merck</td><td>HPA006161</td><td>Western Blot Antikörper</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Fluoreszierende Partikel</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel 100 kDa MWCO</td><td>Merck</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>VER01 - Verity Shells</td><td>Exometrie</td><td></td><td>Organo-Kieselsäurekügelchen für die Streukalibrierung</td></tr></tbody></table>

festlegen einer erfolgreichen sortierung für die isolierung extrazellulärer vesikel

Setting a Successful Sorting for Extracellular Vesicle Isolation

Die FSC-Polystyrolkügelchen wurden sortiert, um die Einrichtung des Instruments und die Sortierbedingungen zu validieren. FSC-Polystyrolkügelchen sind eine Mischung aus fluoreszierenden Kügelchen von 100 nm, 300 nm, 500 nm und 900 nm und sind auf dem FITC-Kanal sichtbar. Abbildung 7A zeigt die SSC-Log-Skala im Vergleich zum FITC-Log-Skala-Punktdiagramm mit den vier Populationen von Perlen vor der Sortierung. Die fluoreszierenden Populationen von 100 nm, 300 nm und 500 nm wurden gated und sortiert. Als erster Proof of Concept wurden sortierte Kügelchen auf Reinheit und Anreicherung analysiert (Abbildung 7B). Alle Populationen waren nach der Sortierung rein. Das Referenz-Hintergrundrauschen ist in den Punktdiagrammen vor und nach der Sortierung immer sichtbar.
Um die in MISEV2018/2023 aufgeführten Anforderungen zu erfüllen und die Beschaffenheit von Vesikeln und ihren Reinheitsgrad nachzuweisen, wurden Versuche durchgeführt, um Marker zu analysieren, die auf EVs vorhanden oder nicht vorhanden sind. EVs sind positiv für einige spezifische Oberflächenmarker15: CD9, CD63, CD81 und CD44. CD9, CD63 und CD81 gehören zur Familie der Tetraspanine von Membranproteinen und sind die gebräuchlichsten Marker zur Identifizierung von Exosomen16. CD44 ist ein Marker, der von MSCs und ASCs stark exprimiertwird 17.
EVs sind auch positiv für das zytosolische Protein Caveolin, wie das intrazelluläre Durchflusszytometrie-Experiment zeigte. Zusätzlich bestätigt der Western Blot die Positivität für CD9, CD81, TSG101, Flotillin und die Negativität für Calnexin (Abbildung 2).
Als nächstes wurden CFSE-markierte ASC-EVs sortiert, wie im Protokoll berichtet. Dieser Sortiervorgang wurde viermal wiederholt, wobei genau die gleichen Bedingungen für die Probenvorbereitung, das Färben und die Sortierung beibehalten wurden (Tabelle 1). Auf diese Weise wurde die Wiederholbarkeit des Protokolls demonstriert.
Es wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die CFSE-sortierte ASC-EVs-Population zu analysieren und zu zeigen, dass sich ihre Eigenschaften durch die Sortierung nicht verändert haben. Insbesondere ändert sich die Expression von CD9, CD63, CD81 und CD44 nach der Sortierung nicht (Abbildung 6A).
Ein weiterer kritischer Punkt betrifft die Abmessungen der Elektrofahrzeuge und wie sie sich nach dem Sortiervorgang aufgrund der durch den Druck induzierten Belastung verändern können. Die Nachsortieranalyse war aufgrund der geringen Probenmenge schwierig durchzuführen, aber die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigt, dass die Verteilung der beiden ASC-EVs-Proben (vor und nach der Sortierung) gleich war (Abbildung 6B). Schließlich zeigt die Analyse von EVs mittels TEM, dass sich ihre Morphologie nach der Sortierung nicht signifikant zu verändern scheint (Abbildung 6C).
Bemerkenswert ist, dass, wie in den MIFlowCyt-EV-Rahmenrichtlinien18 vorgeschlagen, eine Verringerung der Menge an CFSE-positiven EVs bei einer Behandlung mit 0,1 % Triton X-100-Proben beobachtet wurde, was ihren vesikulären Ursprung unterstützt (Abbildung 8).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig07.jpg"> 
Abbildung 7: Sortierung von FSC-Polystyrolperlen. (A) SSC/FITC-Punktdiagramm der Kügelchen vor dem Sortieren. SSC/FITC-Punktdiagramm der nach der Sortierung erneut analysierten Kügelchen: (B) 100 nm sortierte Kügelchen, (C) 300 nm sortierte Kügelchen und (D) 500 nm sortierte Kügelchen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig08.jpg"> 
Abbildung 8: Degradation der EV-Membran in Gegenwart von Triton X-100. Triton X-100 in einer Konzentration von 0,1 % wurde der Probe für 15 Minuten bei Raumtemperatur zugesetzt. Repräsentative Streudiagramme aus drei unabhängigen Experimenten mit unbehandelten (links) und behandelten (rechts) Proben werden berichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experiment</td>
			<td>Anzahl der sortierten Elektrofahrzeuge</td>
			<td>Anzahl der CFSE+ -sortierten Elektrofahrzeuge</td>
			<td>Druck (psi)</td>
			<td>Düse mm</td>
			<td>Frequenz (Hz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>74 x 106 cm</td>
			<td>4,8 x 106 cm</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>44 x 106 cm</td>
			<td>7 x 106 cm</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>38 x 106 cm</td>
			<td>3 x 106 cm</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>16 x 106 cm</td>
			<td>2 x 106 cm</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Wiederholbarkeit des Sortiervorgangs

Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Extracellular vesicles (EVs) released by mesenchymal stromal cells (MSCs) contain a set of microRNAs with regenerative and anti-inflammatory roles. ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

Dieses Video beschreibt die Technik zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus frischem oder gefrorenem Gewebe. Die isolierten extrazellulären Vesikel können für weitere Analysen verwendet werden, um ihre bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Krankheit aufzudecken.

Extraktion extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben mittels Differenzialzentrifugation

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

Leberschädigungen durch Vorläuferzellexpansion begleitet, die eine heterogene Zellpopulation darstellt. Neuartige Klassifizierung dieses Zellkompartiment ermöglicht die Unterscheidung von mehreren Untergruppen. Das hier beschriebene Verfahren zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse und hoher Reinheit Isolierung verschiedener Untermengen, die für die weiteren Tests verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

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Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

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