Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt daher auf der Untersuchung mesenchymaler Stromazellen, extrazellulärer Vesikel für die Geweberegeneration. Ein Thema und ein Ziel unserer Forschung ist es, den zellfreien Ansatz in die klinische Anwendung neben Zelltherapien zu überführen. Die Charakterisierung ist von entscheidender Bedeutung, und heute ist es sehr schwierig, reines Vesikel für eine tiefe Charakterisierung zu haben, da es keine Protokolle gibt, um eine hohe Reinheit zu erreichen.

Daher wollten wir die Zellsortierer-Technologie implementieren, um diesen neuen Ansatz, der auf extrazellulären Vesikeln basiert, zu untersuchen, zu charakterisieren und schließlich in die klinische Praxis umzusetzen. Unser Protokoll besteht aus vier Teilen: der Probenvorbereitung, der Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, der Sortierung und der Nachsortieranalyse. Wir werden uns auf den Sortierteil konzentrieren. Wie Sie sehen werden, werden einige Befehle auf der Sortiersoftware ausgeführt, während andere auf dem Touchscreen ausgeführt werden.

Unser Protokoll bietet erhebliche Vorteile im Vergleich zu anderen Methoden der EV-Trennung. Erstens bewahrt die Verwendung von 70-Mikro-Düsen bei 35 psi die Integrität der EV-Nachsortierung. Dann ist es möglich, eine bestimmte Population von EV zu isolieren und schließlich ermöglicht das Gerät das Speichern der Sortiereinstellungen, um den Prozess reproduzierbar zu machen.

In unserem Labor arbeiten wir an der Entwicklung eines neuen mehrfarbigen Panels für die Analyse extrazellulärer Vesikel. Insbesondere konzentrieren wir uns auf den Aufbau der Instrumente und auf die Erforschung von Fluorochromen. Wir glauben, dass die Möglichkeit, seltene Populationen von Vesikeln zu identifizieren und zu trennen, eine gute Verbesserung ihrer Charakterisierung und auch für die Untersuchung ihrer Rolle in biologischen Prozessen darstellen könnte.

Öffnen Sie zunächst die Druckleitung und das Vakuumsystem des Zellensorters. Schalten Sie das Gerät ein, öffnen Sie die Biosicherheitswerkbank und starten Sie die Sortiersoftware. Beaufschlagen Sie das Fluidiksystem unter Druck und schalten Sie dann das Fluidiksystem ein.

Aktivieren Sie den Drop-Drive, den piezoelektrischen Kristall in der Düse, der vibriert, um Tröpfchen zu erzeugen. Führen Sie das Entblasungsverfahren durch, um Blasen im System zu beseitigen. Lassen Sie dann ein Fünf-Milliliter-Röhrchen Reinigungslösung fünf Minuten lang bei hohem Differenzdruck laufen, gefolgt von einem Fünf-Milliliter-Röhrchen mit entionisiertem Wasser für fünf Minuten.

Um den manuellen Startvorgang durchzuführen, gehen Sie zur Registerkarte Lasersteuerung und schalten Sie die Laserleistung ein. Untersuchen Sie die vertikale Ausrichtung des Streams. Für die Laserspotbestimmung drücken Sie die Lasche für den Laserstrahlabfang.

Klicken Sie auf die grüne Pfeilschaltfläche und folgen Sie den Anweisungen auf dem Touchscreen-Monitor. Initialisieren Sie IntelliSort, und legen Sie die Drop-Laufwerksfrequenz zusammen mit dem Standardamplitudenwert fest, der bewirkt, dass der Stream ein Tröpfchen bildet. Für die Feinausrichtung des Lasers wird ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit QC-Ausrichtungsperlen in den Probenehmer geladen und im QC-Protokoll ausgeführt.

Wählen Sie auf der Registerkarte Feinausrichtung die gewünschten Parameter auf der X- und Y-Achse aus, um gut verdichtete und kollumierte Sicken zu visualisieren. Sobald die manuelle Ausrichtung überprüft ist, führen Sie die automatische Qualitätskontrolle durch, wobei der Durchmesser der QC-Kügelchen auf drei Mikrometer eingestellt ist. Speichern Sie die QC-Erfassung im Software-Alignment-Protokoll.

Um IntelliSort abzuschließen, platzieren Sie die Umlenkplatten an der richtigen Position im Sortierer, und schalten Sie die Spannung auf etwa 3.000 Volt ein. Wählen Sie die Sortierleistung für den Sechsrohrhalter. Wählen Sie die Streams auf dem Stream-Indikator aus, um sie zu aktivieren und den Test-Stream durchzuführen.

Aktivieren Sie die Schaltfläche IntelliSort zur Bestimmung der automatischen Drop-Verzögerung, um die richtige Drop-Verzögerung festzulegen und die Streams erneut zu überprüfen. Aktivieren Sie dann den IntelliSort-Wartungsmodus, und überprüfen Sie die Drop-Verzögerung manuell. Laden Sie das manuelle Drop-Delay-Protokoll in die Sortiersoftware und erfassen Sie fluoreszierende Kontrollperlen.

Nachdem Sie den richtigen Folienhalter eingefügt haben, wählen Sie Sortieren aus, gefolgt vom Drop-Delay-Assistenten und der Sortierlogik. Überprüfen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, dass 97 % der fluoreszierenden Kügelchen auf der fünften Pfütze vorhanden sind. Richten Sie zunächst die Zellensortierung ein, und aktivieren Sie IntelliSort.

Führen Sie nach der Streukalibrierung die Probenerfassungsschritte für jede Probe durch. Um ein neues Protokoll für die Probensortierung zu erstellen, wählen Sie in der Symbolleiste Datei gefolgt von Protokoll und Neu aus. Klicken Sie in der Sortiersoftware auf die Einstellung für die Datenerfassung.

Wählen Sie im Fenster mit den Akquisitionsparametern die gewünschten Kanäle aus und deaktivieren Sie die anderen. Legen Sie dann ein Fünf-Milliliter-Röhrchen der Probe in den Probenehmer. Klicken Sie auf dem Touchscreen auf die Schaltfläche Laden.

Wählen Sie in der Symbolleiste der Sortiersoftware die Option Erfassung aus und drücken Sie Start. Wenn das Fenster mit den Beispieleigenschaften angezeigt wird, geben Sie den Namen des Beispiels ein und klicken Sie auf OK. Um die Gating-Strategie zu erstellen, wählen Sie Histogramm und dann Histogramm erstellen.

Erstellen Sie drei Punktdiagramme, das erste mit dem Protokoll "488-FSC1-Height" auf der X-Achse und dem Protokoll "488-SSC-Height" auf der Y-Achse. Das zweite mit 488-FSC-2 Höhenprotokoll auf der X-Achse und 488-SSC-Höhenprotokoll auf der Y-Achse, und das dritte mit 488 513 x 26 CFSE Höhenprotokoll auf der X-Achse und 488-SSC Höhenprotokoll auf der Y-Achse. Klicken Sie auf Erfassung, gefolgt von Start und geben Sie den Namen der Probe ein.

Zeichnen Sie während der Erfassung eine Region, die die negativen CFSE-Ereignisse identifiziert, und eine Region, die die positiven CFSE-Ereignisse identifiziert. Identifizieren Sie dann auf der Registerkarte Sortieren die Region, die sortiert werden soll. Wenn die Durchflussrate stabil ist, wählen Sie Erfassung, gefolgt von Stopp.

Starten Sie die Sortierung, indem Sie in der Symbolleiste der Sortiersoftware Sortieren auswählen. Um die Sortiereinstellungen zu speichern, wählen Sie in der Symbolleiste Sortieren aus, und klicken Sie dann auf Sortiereinstellungen speichern. Um die Reinheit der sortierten Population zu überprüfen, besorgen Sie sich zuerst ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit Reinigungslösung für 10 Minuten bei hohem Differenzdruck, gefolgt von einem Fünf-Milliliter-Rohr mit entionisiertem Wasser für 10 Minuten.

Erfassen Sie 0,22-Mikrometer-, gefilterte PBS und prüfen Sie, ob keine positiven CFSE-Ereignisse vorhanden sind. Verdünnen Sie dann fünf Mikroliter der sortierten Probe in 100 Mikrolitern 0,22 Mikrometer, filtriertem PBS. Erfassen Sie die sortierten Proben und erfassen Sie die Volumina Die Expression von CD9, CD63, CD81 und CD44 in den aus Fettgewebe gewonnenen extrazellulären Vesikeln änderte sich nach der CFSE-Sortierung nicht.

Die Analyse der Nanopartikelverfolgung zeigte, dass die Größenverteilung der Vesikel vor und nach der Sortierung konstant blieb. Die transmissionselektronenmikroskopische Analyse zeigte, dass die Morphologie der Vesikel durch den Sortierprozess nicht signifikant verändert wurde. Zusätzlich reduzierte die Behandlung 0,1 %Triton X-100 die Anzahl der CFSE-positiven Vesikel, was ihren vesikulären Ursprung bestätigte.