Name: Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus mit Kollagenase-Typ-I-Verdauung und Ultrazentrifugation. Diese Methode erhält die Membranintegrität und ermöglicht funktionelle Studien zur kardiovaskulären Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Proben wurden von Mäusen gewonnen, mit ethischer Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Universität Guangdong. Detaillierte Beschreibungen der Materialien, Geräte und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Die Details der Präparation vor der Extraktion sind in Abbildung 1 dargestellt, während der Prozess der Milz-Exo-Extraktion und -Anreicherung in Abbildung 2 beschrieben ist.
1. Vorbereitung
<ol>
	<li>Kühle Hochgeschwindigkeits- und Ultrahochgeschwindigkeitszentrifugen auf 4 °C vor und stelle die Temperatur eines Desktop-Schüttlers auf 37 °C ein.</li>
	<li>Bereiten Sie Zellkulturschalen (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm), sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen, Eis und ein steriles Zellsieb (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) vor, wie in Abbildung 1A, B gezeigt.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Scheren und Pinzetten mit 75%igem Alkoholspray, gefolgt von einer Hochtemperatursterilisation. Diese Werkzeuge sind in Abbildung 1C dargestellt.</li>
	<li>Legen Sie das Milzgewebe in eine sterile <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm Petrischale auf Eis und waschen Sie das Oberflächenblut mit 1x eisgekühlter steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Trocknen Sie das Milzgewebe mit steriler Gaze und wiegen Sie es nach dem Trocknen. HINWEIS: Wenn das Taschentuch gefroren ist, tauen Sie es in einer Schüssel 15 Minuten lang auf Eis auf, bevor Sie fortfahren.</li>
	<li>Befeuchten Sie das Zellsieb (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm), indem Sie 1 ml steriles PBS mit einer sterilen Transferpipette in das Sieb geben.</li>
	<li>Bereiten Sie den Verdauungspuffer (0,1 % Kollagenase Typ I) mit 1x PBS mit einem Vortex-Mischer vor. HINWEIS: Verwenden Sie 10 ml Verdauungspuffer pro 100 mg Milzgewebe. Die Kollagenase-Konzentration wurde in dieser Studie auf der Grundlage der Produktanweisungen ausgewählt. Bei anderen Gewebetypen müssen Forscher diese Parameter möglicherweise basierend auf der Gewebedichte und -zusammensetzung anpassen. Es werden Vorversuche mit unterschiedlichen Konzentrationen und Verdauungszeiten empfohlen, um die optimalen Bedingungen für jeden Gewebetyp zu ermitteln.</li>
</ol>
2. Verdauung des Gewebes
<ol>
	<li>Das Gewebe wird mit einer Schere in einer Kulturschale auf Eis in gleichmäßige kleine Stücke geschnitten (Abbildung 3A) und mit einer sterilen Transferpipette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.</li>
	<li>Geben Sie Verdauungspuffer entsprechend dem Gewicht des Milzgewebes in das Röhrchen, wie oben angegeben (Abbildung 3B), und schütteln Sie das Röhrchen dann mit einem Winkel von 45° auf einem horizontalen Schüttler bei 37 °C. Überwachen Sie den Verdauungsfortschritt und stoppen Sie die Verdauung, wenn sich Gewebebrocken verteilt haben und die meisten ihre Form verloren haben. Die Verdauungszeit sollte von Gewebe zu Gewebe variieren. Unter den experimentellen Bedingungen in dieser Studie beträgt die Aufschlusszeit ca. 30 min.</li>
	<li>Die verdaute Mischung wird in ein Zellsieb (T70 μm) bei Raumtemperatur (RT) überführt, um faserige und größere Gewebereste zu entfernen. HINWEIS: Vollständige Filtration sofort nach dem Aufschluss.</li>
	<li>Sammeln Sie das Filtrat in einem neuen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
</ol>
3. Isolierung von Exosomen durch Differenzialzentrifugation
<ol>
	<li>Filtrifugenfiltrate bei 500 x g für 10 min bei 4 °C. Ein Pellet mit Restzellen, Zelltrümmern und Zellkernen ist nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3C gezeigt.</li>
	<li>Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 3000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Ein Pellet, das apoptotische Körper und Mikrosomen enthält, ist nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3D gezeigt.</li>
	<li>Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Pellets, die Mikrovesikel und Plasmamembran enthalten, sind nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3E gezeigt.</li>
	<li>Den resultierenden Überstand bei 120.000 x g für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugieren. Am Boden des Röhrchens ist nach der Zentrifugation ein Pellet zu sehen, wie in Abbildung 3F gezeigt.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen, das Pellet mit PBS waschen und erneut bei 120.000 x g für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugieren, um Exosomen zu erhalten. Am Boden des Röhrchens ist nach der Zentrifugation ein Pellet zu sehen, wie in Abbildung 3G gezeigt.</li>
	<li>Die isolierten Exosomen werden mit sterilem PBS (200 μl pro Milz) aufgelöst und die isolierten Exosomen in einem neuen 2 mL Zentrifugenröhrchen bei -80 °C gelagert.</li>
</ol>
4. Charakterisierung von Exosomen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
HINWEIS: Es wurde TEM verwendet, um festzustellen, ob das extrahierte Exo Vesikeleigenschaften aufwies. Die elektronenmikroskopisch identifizierten Exo-Proben müssen frische Proben sein oder kurzzeitig bei 4 °C gelagert werden.
<ol>
	<li>Fixieren Sie Exosomen (2-6 μg/μl) mit 2 % Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopie (EM)-Qualität bei RT für 2 h.</li>
	<li>10 μl Exosomenlösung auf ein Kupfernetz geben, 10 Minuten bei RT inkubieren, mit sterilem destilliertem Wasser abspülen und überschüssige Flüssigkeit mit saugfähigem Papier abtupfen.</li>
	<li>Das Kupfergewebe 1 min lang mit 2% Uranylacetat einfärben, überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abtupfen und 2 min unter einer Glühlampe trocknen.</li>
	<li>Betrachten Sie die vorbereitete Probe unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV.</li>
</ol>
5. Messung der Größenverteilung und Partikelkonzentration von Exosomen
<ol>
	<li>Laden Sie die Standard-Polystyrol-Nanopartikel (250 nm) in das Nano-Durchflusszytometer.</li>
	<li>Messen Sie die Proteinkonzentration von Exo-Proben mit einem BCA-Protein-Assay-Kit. Verdünnen Sie die Exo-Probe mit PBS gemäß den Ergebnissen des BCA-Protein-Assays (verdünnen Sie die Exosomen auf 1-10 ng/μl) und laden Sie dann die Exo-Proben in den Nano-Flow, um die Intensität der Seitenstreuung (SSI) zu messen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Exo-Konzentration entsprechend dem Verhältnis von SSI zu Partikelkonzentration in den Standard-Polystyrol-Nanopartikeln. HINWEIS: Für die Größenmessung wird eine Standardkurve erstellt, indem Standard-Siliziumdioxid-Nanopartikel mit Gradientengrößen (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) in das Nano-Durchflusszytometer geladen werden. Daran schließt sich die Beladung der Exo-Probe an. Die Größenverteilung von Exo wurde nach der Standardkur berechnet.</li>
</ol>
6. Lyse und Immunoblot-Bestätigung von Exosomenproteinen
<ol>
	<li>Geben Sie 100 μl RIPA-Lysepuffer (Radio Immunoprecipitation Assay) für die Proteinanalyse in das Exosom-Pellet.</li>
	<li>Kräftig vortexen, mit Parafilm bedecken, 20 min bei RT rocken, dann wieder vortexen.</li>
	<li>Zur Entnahme der Probe kurz bei 1000 x g zentrifugieren, in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und bis zur Analyse bei -20 °C bis -80 °C lagern.</li>
	<li>Mischen Sie für Immunoblot die Proben mit 5x Ladepuffer, um eine 1x-Konzentration zu erreichen, und bereiten Sie die Gelelektrophorese vor.</li>
	<li>Wenn Ganzgewebe-Homogenatkontrollen gewünscht werden, verwenden Sie einen starken Lysepuffer mit einem Proteaseinhibitor, um das Gewebe zu lysieren, wie oben beschrieben. Zentrifugieren Sie dann die Proben 10 Minuten lang bei 10.000 x g und verwerfen Sie die verbleibende extrazelluläre Matrix, ganze Zellen oder intakte Zelltrümmer.</li>
	<li>Kochen Sie den Probenpuffer, der Exosomen oder Gewebehomogenat enthält, bei 95 °C für 5-10 min. Laden Sie das gleiche Protein pro Bahn in ein 10% SDS-PAGE-Gel. Laden Sie das gleiche Protein des Gewebehomogenats als Kontrolle.</li>
	<li>Die Gelelektrophorese unter einer Spannung von 80 V für ca. 2 h unter Verwendung des herkömmlichen Elektrophoresepuffers durchführen. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um die Exo-Proteinexpression in den gereinigten Lysaten zu bestätigen und die relative Exo-Häufigkeit in Fraktionen zu vergleichen.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Verfeinerungstechniken für die Isolierung von murinen Milz-abgeleiteten Exosomen

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Front Mol Biosci. 7, 33(2020).</li>
<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enrichment+method+for+small+extracellular+vesicles+derived+from+liver+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue.</a> J Vis Exp. (192), e64499(2023).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 & Mikro; m Cell Strainer</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD9 Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>Anti GM130 Antikörper</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>66662-1-lg</td><td></td></tr><tr><td>Anti TSG101 Antikörper</td><td>Abcam Plc, UK</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., USA</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Desktop-Thermostatschüttler</td><td>Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresepuffer</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>Erweitertes BCA-Protein-Assay-Kit</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc., China</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-/Chemilumineszenz-Bildgebungssystem&nbsp;</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziege Anti-Maus</td><td>IgG Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziege Anti-Kaninchen</td><td>IgG Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Shanghai Medizin&nbsp; Instrumente (Gruppe)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopische Pinzette</td><td>Shanghai&nbsp; Medizin&nbsp; Instrumente (Gruppe)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmologische Schere</td><td>Shanghai&nbsp; Medizin&nbsp; Instrumente (Gruppe)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmische Pinzette</td><td>Shanghai&nbsp; Medizin&nbsp; Instruments (Gruppe)&nbsp;Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 Ultrafiltrationszentrifuge</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-Lysepuffer (stark, ohne Inhibitoren)</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>Lineal</td><td>Deli&nbsp; Fertigung&nbsp; Unternehmen, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Probenladepuffer, 5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Hitachi, Japan</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugationsröhrchen</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Puffer&nbsp;</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von exosomen aus milzgewebe der maus

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Isolierung und Reinigung von Exosomen aus der Milz Um Exosomen aus Milzgewebe der Maus zu isolieren, verwendeten wir eine Kombination aus Kollagenaseverdau und differentieller Ultrazentrifugation (Abbildung 2). Die ersten Schritte umfassten die Vorbehandlung des Milzgewebes, um Oberflächenblut zu entfernen, gefolgt von der Verdauung mit Kollagenase Typ I. Diese enzymatische Behandlung erleichterte den Abbau der extrazellulären Matrixkomponenten und befreite so die Exosomen unter Beibehaltung ihrer Integrität. Nach dem Aufschluss wurde eine Reihe von Zentrifugationsschritten durchgeführt, um nacheinander Zelltrümmer, apoptotische Körper und größere Vesikel zu entfernen, was in der Ultrazentrifugation des Überstands bei 120.000 x g gipfelte, um die Exosomen zu pelletieren. Nachfolgende Isolationsverfahren ergaben PBS-lösliche Pellets, die mit Milz-abgeleitetem Exo angereichert waren, wie in Abbildung 3G gezeigt.
TEM-Ergebnisse Die Morphologie der isolierten Exosomen wurde mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie untersucht, einer Goldstandardmethode zur Untersuchung der Charakterisierung von Exosomen. TEM wird häufig verwendet, um das Vorhandensein von Exosomen zu validieren, die Qualität von Exosomen zu bewerten und die Morphologie von Exosomen zu beobachten. Die TEM-Bilder (Abbildung 4A) zeigten das Vorhandensein von becherförmigen Vesikel, die für Exosomen charakteristisch sind. Diese Vesikel wiesen eine klare Lipid-Doppelschichtstruktur auf, was die erfolgreiche Isolierung von Exosomen aus dem Milzgewebe bestätigt.
Größenverteilung von Spleen-Exo Die Größenverteilung und Konzentration der Exosomen wurde mit Hilfe eines Nano-Durchflusszytometers bestimmt. Die Ergebnisse (Abbildung 4B) zeigten, dass der Durchmesser der isolierten Exosomen zwischen 30 und 150 nm lag, mit einer Spitzenkonzentration bei etwa 60 nm. Der Durchmesser der isolierten Partikel lag überwiegend zwischen 50 und 80 nm, mit einer mittleren Partikelkonzentration von 4,6 x 109 Partikeln/ml. Dieser Größenbereich stimmt mit den zuvor berichteten Eigenschaften von Exosomen überein und validiert das Isolationsprotokoll weiter.
Western-Blot-Analyse Um das Vorhandensein von exosomalen Markern zu bestätigen, führten wir eine Western-Blot-Analyse durch. Die exosomalen Marker TSG101 und CD9 wurden in den Milz-Exo-Proben nachgewiesen, während GM130, ein Golgi-Matrixprotein, das als Negativkontrolle verwendet wurde, nicht nachgewiesen wurde (Abbildung 4C). Im Vergleich dazu wurde das Protein dieser Marker in Milzgeweben von Mäusen exprimiert (Milz-T). Dies deutet auf die hohe Reinheit der isolierten Exosomen hin, da sie frei von zellulären Verunreinigungen waren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Vorbereitung der Versorgung. (A) 50-ml-Zentrifugenröhrchen, Kulturschalen, Eis und chirurgische Instrumente wurden in einer Biosicherheitswerkbank untergebracht. (B) Ein steriles Zellsieb (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm). (C) Sterilisierte chirurgische Instrumente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Verfahren zur Isolierung der Milz-Exo. Bereiten Sie Milzgewebe vor und schneiden Sie es in eisgekühltem PBS in kleine Stücke, gefolgt von einem Aufschluss mit Kollagenase Typ I und einer Zentrifugation wie angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Milz-Exo-Isolierung. (A) Kleine Milzblöcke, die für die anschließende Verdauung bereit sind. (B) Milzgewebeblöcke mit Verdauungspuffer. (C) Pellets nach 500 x g Zentrifugation. (D) Pellets nach 3.000 x g Zentrifugation. (E) Pellets nach 10.000 x g Zentrifugation. (F) Pellets nach 120.000 x g Zentrifugation. (G) Exosomenpellets nach 120.000 x g Zentrifugation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Identifizierung von Spleen-Exo. (A) TEM-Ergebnisse, die isolierte Partikel als runde oder ovale membranöse Vesikel mit becherförmiger Morphologie zeigen. Maßstabsleiste = 200 nm bzw. 50 nm. (B) Die Analyse der Größenverteilung mit dem Flow Nano Analyzer zeigte, dass der Durchmesser von Spleen-Exo überwiegend zwischen 50 nm und 80 nm lag, mit einer mittleren Partikelkonzentration von 4,6 × 109 Partikeln/ml. (C) Western-Blot-Analyse, die die Expression von Exosomen-spezifischen Markerproteinen (TSG101 und CD9) in Spleen-Exo zeigt, mit negativer Expression von GM130. Diese Marker waren in Proteinproben nachweisbar, die aus der Milz der Maus extrahiert wurden (Milz-T-Gruppe). Es wurden die repräsentativen Western-Blot-Bilder gezeigt (n = 6 Gewebe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

isolation-characterization-exosomes-derived-from-mouse-spleen

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt eine einfache, zeitsparende Technik für die automatisierte Gewebedissoziation mit dem gentleMACS Dissociator zu Single-Zellsuspensionen von Maus-Splenozyten vorzubereiten.

Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Es werden Techniken beschrieben, die ein Gradientenverfahren zur Trennung von Exosomen von Partikeln des humanen Immundefizienzvirus (HIV) beschreiben. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Exosomen weg von HIV-Partikeln im menschlichen Plasma von HIV-infizierten Personen zu isolieren. Die isolierten Exosomen wurden auf ihren Zytokin-/Chemokingehalt analysiert.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dendritische Zellen aus murinen Milz von magnetischen Zellsortierung und späteren Adoptiveltern Übertragung ins naive Mäuse zu isolieren. Das Modell von hohem Salzgehalt aktivierten dendritischen Zellen wurde gewählt, um die schrittweisen Verfahren Adoptiv-Transfer und Durchflusszytometrie zu erklären.

Isolation und Adoptiveltern Übertragung von hohen Salz behandelt Antigen-präsentierende dendritische Zellen

Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.

Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen aus mikrodissektierten Maus-Aderhautplexus

Lernen Sie die Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus mit Kollagenase-Typ-I-Verdauung und Ultrazentrifugation. Diese Methode erhält die Membranintegrität und ermöglicht funktionelle Studien zur kardiovaskulären Forschung.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus

Weitere Videos entdecken