Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus
20. September 2024
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Milz-Exosomen von Mäusen vor, wobei eine Kombination aus Verdau mit Kollagenase Typ I und Ultrazentrifugation verwendet wird.
Gewebeabgeleitete Exosomen haben aufgrund ihrer Fähigkeit, die Gewebespezifität und die Mikroumgebung genau widerzuspiegeln, zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Erforschung der grundlegenden und translationalen Rolle von Milz-abgeleiteten Exosomen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen. In dieser Studie entwickeln wir ein praktisches Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe von Mäusen, das eine reproduzierbare Technik für nachfolgende Identifizierungsanalysen und funktionelle Studien bietet.
Wir verwenden eine Typ-I-Kollagenase für den Aufschluss, gefolgt von der Filtration durch differentielle Ultrazentrifugation, um ein hochwertiges Milz-Exosom zu erhalten. Im Gegensatz zu früheren Berichten bewahrt unser Ansatz bei der Verwendung von Gewebehomogenisierung zur Gewinnung einer Gewebesuspension die Membranintegrität von Zellen im Gewebe. Diese Technik könnte besonders nützlich sein, um die Rolle des Exosoms bei der Immunantwort zu untersuchen.
Angesichts der kritischen Funktion der Milz im Immunsystem könnten zukünftige Studien dieses Protokoll an menschliches Gewebe anpassen und so die Extraktion klinisch relevanter Exosomen für diagnostische und therapeutische Zwecke ermöglichen. Kühlen Sie zunächst die Hochgeschwindigkeits- und Ultrahochgeschwindigkeitszentrifugen auf vier Grad Celsius vor und stellen Sie die Temperatur des Tischschüttlers auf 37 Grad Celsius ein. Bereiten Sie die Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern vor.
Ordnen Sie dann 50 Milliliter sterile Zentrifugenröhrchen, Eis und sterile Zellsiebe mit einem Durchmesser von 70 Mikrometern an. Sprühen Sie 75% Alkohol, um die Schere und Pinzette zu sterilisieren, und erhitzen Sie sie auf eine hohe Temperatur, um sie weiter zu sterilisieren. Legen Sie dann das Milzgewebe in eine sterile 100 Millimeter Petrischale auf Eis und waschen Sie das Oberflächenblut mit kaltem 1X PBS ab.
Trocknen Sie die Milz gründlich mit steriler Gaze ab, bevor Sie das Gewebe wiegen. Geben Sie anschließend mit einer sterilen Transferpipette einen Milliliter PBS in ein 70-Mikrometer-Zellsieb, um es zu befeuchten. Bereiten Sie schließlich 0,1 % Typ-I-Kollagenase in 1X PBS mit einem Vortex-Mischer vor, um den Aufschlusspuffer zu erhalten.
Bereiten Sie zunächst die Reagenzien und die sterilen Werkzeuge für die Gewebeverarbeitung vor. Schneiden Sie das Milzgewebe mit einer Schere in einer Kulturschale auf Eis in kleine, gleichmäßige Stücke und geben Sie diese mit einer sterilen Transferpipette in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann den Verdauungspuffer basierend auf dem Gewicht des Milzgewebes in das Röhrchen und schütteln Sie das Röhrchen in einem 45-Grad-Winkel auf einem horizontalen Shaker, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Gewebebrocken zerstreut haben und die meisten Stücke ihre Form verloren haben. Übertragen Sie die verdaute Mischung bei Raumtemperatur durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb, um faserige und größere Gewebereste zu entfernen. Sammeln Sie das Filtrat in einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 500 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt bei geeigneter Geschwindigkeit. Nach der Ultrazentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet mit PBS waschen.
Ultrazentrifugieren Sie erneut bei 120.000 G für zwei Stunden bei vier Grad Celsius, um die Exosomen zu isolieren. Zum Schluss lösen Sie die isolierten Exosomen in 200 Mikrolitern sterilem PBS pro Milz auf und lagern sie in einem zwei Milliliter Zentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten das Vorhandensein von becherförmigen Vesikeln mit einer Lipiddoppelschicht, die für Exosomen charakteristisch ist.
Die Exosomengrößen reichten von 30 bis 150 Nanometern, wobei die Spitzenkonzentration bei 60 Nanometern lag, wie das Größenverteilungsdiagramm zeigt. Die Western-Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein der exosomalen Marker TSG101 und CD9, während GM130 und die Negativkontrolle nicht nachgewiesen wurden.
Überblick
Diese Studie präsentiert ein praktisches Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus Maus-Milzgeweben, was für das Verständnis ihrer Rolle bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen entscheidend ist. Die Methode kombiniert Collagenase Typ I Verdauung mit Ultrazentrifugation und gewährleistet dabei eine hochwertige Exosomen Ausbeute bei gleichzeitiger Erhaltung der Zellmembran-Integrität.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Herz-Kreislauf-Forschung
Hintergrund
- Aus Geweben stammende Exosomen spiegeln Gewebespezifität und Mikroumgebung wider.
- Milz-abgeleitete Exosomen spielen eine Rolle bei Immunreaktionen.
- Das Verständnis der Exosomenfunktion ist für die Herz-Kreislauf-Erkrankungsforschung von entscheidender Bedeutung.
- Frühere Methoden können die Membranintegrität beeinträchtigen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines reproduzierbaren Protokolls zur Isolierung von Milz-abgeleiteten Exosomen.
- Erleichterung der anschließenden Identifizierungsanalyse und funktioneller Studien.
- Verbesserung des Verständnisses der Rolle von Exosomen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Verdauung von Milzgewebe mittels Collagenase Typ I.
- Filtrierung durch differentielle Ultrazentrifugation.
- Isolierung von hochwertigen Exosomen.
- Erhaltung der Zellmembran-Integrität während des Prozesses.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Milz-abgeleiteten Exosomen.
- Hochwertige Exosomen geeignet für weitere Analysen.
- Die Methode zeigt eine verbesserte Erhaltung der Membranintegrität.
- Potenzielle Anwendungen bei der Untersuchung von Immunreaktionen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ist effektiv zur Isolierung von Exosomen aus der Mausmilz.
- Diese Technik kann die Forschung zu Exosomenfunktionen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbessern.
- Zukünftige Studien können diese Methode für verschiedene Anwendungen in der Immunologie nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of spleen-derived exosomes enables mechanistic de-risking and target validation in immune and cardiovascular disease research. This protocol supports predictive confidence by preserving exosome integrity and ensuring reproducibility across discovery and translational workflows. The method positions tissue-specific exosome analysis as a reusable capability for biomarker and functional studies in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated signaling pathways in disease-relevant immune tissues.
- Supports biological de-risking by providing tissue-specific extracellular vesicle profiles.
- Facilitates functional target validation through reproducible exosome isolation and marker confirmation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated exosome samples for downstream quantitative and qualitative assays.
- Standardizes exosome isolation for reproducible biomarker and mechanistic screening.
- Enables scalable workflows for comparative analysis of exosome populations across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns exosome characterization with disease-relevant immune and cardiovascular models.
- Supports translational biomarker discovery by reflecting tissue microenvironment and specificity.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of exosome-based hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust exosome isolation for hypothesis testing, biomarker identification, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on exosome-mediated intercellular communication and immune modulation.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated exosome preparations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative size distribution and marker expression data for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling tissue-specific exosome studies relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol adaptable to other tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in exosome research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable exosome isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker and mechanistic studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of exosome-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, ultracentrifugation, and exosome analytics.
- Needs access to high-speed and ultra-high-speed centrifuges, electron microscopy, and western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and analytical protocols.
- Adaptation to other tissues may require optimization of digestion and isolation parameters.
- Yield and purity depend on tissue quality and precise execution of protocol steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Introduction
1:42
Preparation of Equipment and Reagents for Spleen Tissue-Derived Exosome Isolation for Functional Analysis
3:00
Efficient Isolation of Exosomes from Mouse Spleen Using Collagenase Digestion for Biomarker Studies
4:50
Representative Results
