Name: Analyse telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette die Wechselwirkungen zwischen den telomeren DNA-Bindungsproteinen TRF1 und TRF2 sowie menschlichen Telomeren analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen molekularer Kräfte.

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<meta charset="utf8"></head><body>Untersuchung von TRF1/2-Wechselwirkungen mit telomerer DNA mittels Einzelmolekül-Assay

<table><tbody><tr><td>Anti-Digoxigenin</td><td>Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933 CMOS-Kamera</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extraktionslösung</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, Rnase-frei, Hc Ea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mischung</td><td>Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-270&nbsp; Kügelchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65305</td><td>Streptavidin-Kügelchen</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne-Kügelchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>Streptavidin-Kügelchen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Tianjin Nr. 6 Chemische Reagenzfabrik</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Beijing Hwrkchemical Ko. Ltd</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Tianjin No.6 Chemisches Reagenz</td><td>Fabrik A1079</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Klenow-Fragment (3&prime;-5&prime; exo-)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>Grafische Programmiersoftware&nbsp;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Shanghai Aladdin</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NanoDrop Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Spektralphotometer</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTA Beads 6FF</td><td>Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulosemembran</td><td>ABklonal</td><td>RM02801</td><td></td></tr><tr><td>PMSF Solarbio</td><td></td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Sumo-Protease</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse telomerer protein-dna-wechselwirkungen mit einer magnetischen einzelmolekülpinzette

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Abbildung 1A zeigt die schematischen Domänen und Strukturen von TRF1 und TRF2, bestehend aus 439 bzw. 542 Aminosäuren, die in prokaryotischen Zellen exprimiert werden können. Die Herstellung von TRF1 wurde bereits in der Literatur beschrieben41. Im Folgenden finden Sie eine umfassende Beschreibung und repräsentative Ergebnisse der Aufbereitung von TRF2. Abbildung 1B zeigt die Plasmidkarte, die für die Expression von TRF2 in E. coli verwendet wird. Wir untersuchten die TRF2-Expression vor und nach der Induktion in E. coli, wie in Abbildung 1B dargestellt. Die Aufreinigungs- und Tag-Spaltungsprozesse wurden ebenfalls mit SDS-PAGE analysiert (Abbildung 1C). Nach diesem Protokoll wurden beide telomerischen Bindungsproteine, TRF1 und TRF2, erfolgreich in E. coli exprimiert.
Telomere DNA in Form von terminalen Restriktionsfragmenten (TRFs) wird aus menschlichen Genomen mit einer Kombination von vier Restriktionsenzymen erzeugt. In Anlehnung an das in Abbildung 2A gezeigte Flussdiagramm extrahierten wir Genome aus menschlichen Zellen. Die Enzyme verdauen selektiv genomische DNA, während sie die Telomer-DNA in voller Länge intakt lassen, und liefern so Material für Einzelmolekül-Assays. Wir haben das TRF-DNA-Präparat ausgiebig an verschiedenen menschlichen Zelllinien getestet. Die Integrität der genomischen DNA wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese untersucht, wie in Abbildung 2B dargestellt. Die TRFs wurden anschließend mittels Southern-Blot analysiert, wobei fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide verwendet wurden, die zur telomeren Repeatsequenz TTAGGG komplementär sind (Abbildung 2C), nach einer an anderer Stelle beschriebenen Methode41,56. Im Durchschnitt beträgt die Länge menschlicher TRFs etwa einige Kilobasen.
Einzelmolekül-Assays finden in einer Durchflusszelle statt, die wie in Abbildung 3A beschrieben aufgebaut ist. Eine Nitrozellulosebeschichtung bedeckt die negativ geladene Glasoberfläche und bildet eine hydrophile Matrix für die Antikörperadsorption. Die BSA-Passivierung blockiert Bereiche der Nitrozellulosematrix, die nicht durch Anti-Digoxigenin-Antikörper gebunden sind. Als Referenzkügelchen dienen Polystyrolkügelchen, die keine Eisennanopartikel enthalten. TRF-Tether werden durch Affinitätswechselwirkungen zwischen dem Digoxigenin-Antikörper auf der Nitrocellulosematrix und Biotin-Streptavidin auf der magnetischen Bead-Oberfläche gebildet (Abbildung 3B). TRF1 oder TRF2 werden in die Durchflusszelle eingeführt und binden über freie Diffusion an die TRF-DNA-Bindungen. Eine magnetische Pinzette wird verwendet, um das Magnetfeld zu modulieren und Kräfte auf die magnetischen Kügelchen zu erzeugen, um die TRF-Fesseln zu dehnen und zu entspannen, wodurch die Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglicht wird.
Ein mechanischer Einzelmolekül-Assay wird entwickelt, indem ein Skript entwickelt wird, um die Bewegungen der Motoren der magnetischen Pinzette zu steuern. Ein Flussdiagramm bietet einen strukturierten Ansatz zur Erstellung dieses Skripts in MatLab für einen Einzelmolekül-Assay mit einer magnetischen Pinzette (Abbildung 4A). Die Magnete bewegen sich entlang der z-Achse in einem Bereich von 0-25 mm. Die Kräfte werden auf der Grundlage der Magnetpositionen entsprechend der Magnetkonfiguration unter Verwendung von Gleichungen berechnet, die in der Literaturbeschrieben sind 54. Für eine bestimmte Kraft-Belastungs-Rate werden die Magnetpositionen und Bewegungsgeschwindigkeiten in MatLab entworfen und programmiert, um das gewünschte Kraftmanipulationsprofil zu erreichen, wie am Beispiel des Kraftrampen-Assays gezeigt wird (Abbildung 4B-D).
Am Beispiel von TRF1 untersuchten wir die telomeren DNA-Protein-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette. Der Versuchsaufbau kann als Kraft-Rampen-Assay konfiguriert werden, wie in Abbildung 5A gezeigt, wo die Kraft-Extensions-Kurven während der Dehnung aufgrund des Brechens von Protein-DNA-Wechselwirkungen und glatte Spuren während der Relaxation Zickzack-Merkmale aufweisen, die die DNA-Faser ohne Protein-vermittelte Schleifen widerspiegeln. Der Aufbau kann auch als Kraftsprung-Assay konfiguriert werden, wie in Abbildung 5B,C gezeigt, was es uns ermöglicht, Änderungen in der Ausdehnung und die Dauer von Protein-DNA-Wechselwirkungen unter bestimmten Kräften zu messen. Aus diesen Messungen kann die Dissoziationskinetik der telomeren DNA-Protein-Komplexe abgeleitet werden (Abbildung 5D). Zusätzlich kann die Bildung von Schleifen in den DNA-Protein-Komplexen durch Änderungen der Ausdehnung aufgedeckt werden (Abbildung 5E). Darüber hinaus kann die Proteinkonzentration innerhalb dieses telomeren DNA-Versuchsaufbaus titriert werden. Darüber hinaus ermöglicht uns die Längenheterogenität der Telomer-DNA aus menschlichen Zellen, den Schleifenbildungsmechanismus in Telomeren unterschiedlicher Länge zu untersuchen (Abbildung 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Die Expression und Reinigung von TRF1/2. (A) Die Domänenarchitektur von TRF1 und TRF2. (B) Die Plasmidkarte von pET28a-SUMO-TRF2 für die Expression von TRF2 in E. coli. (C) SDS-PAGE-Analyse der Proben, die in verschiedenen Stadien der Expression und Reinigung gewonnen wurden. Spur 1: Nicht induziert durch IPTG. Spur 2: IPTG-induzierter Niederschlag, der durch Zelllyse gewonnen wird. Spur 3: IPTG-induzierter Überstand, der nach Zelllyse gewonnen wurde. Spur 4: Fließen Sie durch die Nickel-Säule. Spur 5: Mit niedrigem Imidazol-Puffer waschen, um verunreinigte Proteine zu entfernen. Spur 6: Elution von 6xHis-SUMO-TRF2 mit Puffer, der 300 mM Imidazol enthält. Spur 7: Verdau von SUMO-Tags durch das SUMO-Protease-Enzym. Spur 8: Aufreinigung mit Ni-Säule und Elution von TRF2 (6xHis- und SUMO-Tags entfernt) mit Puffer mit 20 mM Imidazol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg"> Abbildung 2: Präparation von terminalen Restriktionsfragmenten (TRF). (A) Flussdiagramm für die Präparation von TRFs aus humanen Zellen. (B) Untersuchung der genomischen DNA-Integrität unter Verwendung eines 1%igen Agarosegels für 5 menschliche Zelllinien. (C) TRF-Analyse, durchgeführt durch Southern-Blotting für 5 menschliche Zelllinien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg"> Abbildung 3: Vorbereitung von mechanischen Einzelmolekül-Assays. (A) Flussdiagramm, das die Vorbereitung einer Durchflusszelle für mechanische Einzelmolekül-Assays darstellt. (B) Schematische Darstellung von mechanischen Einzelmolekül-Assays unter Verwendung einer magnetischen Pinzette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg"> Abbildung 4: Design eines mechanischen Einzelmolekül-Assays. (A) Flussdiagramm zur Generierung eines Skripts zur Durchführung eines Kraft-Rampen-Assays. (B) Das Bewegungsprofil von Magneten entlang der z-Achse. (C) Das Kraftprofil, das der Magnetbewegung entspricht. (D) Die Korrelation zwischen den Magnetpositionen und den daraus resultierenden Kräften. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg"> Abbildung 5: Telomere DNA-Protein-Wechselwirkungen, die mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette untersucht wurden. (A) TRF1-Telomer-Wechselwirkungen wurden in Kraftrampen-Assays (N = 10) in einem Puffer untersucht, der 20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA und 100 mM NaCl bei 23 °C enthielt. Die Konzentration von TRF1 betrug 10 nM mit einer Kraftbelastungsrate von ±1 pN/s. (B) Das TRF-Tether wurde in Kraftsprung-Assays gedehnt und entspannt. Das Protokoll der angewendeten Kraft lautete: Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN und Fmax = 20 pN. Die Puffer- und Temperaturbedingungen waren die gleichen wie in (A). Bildrate = 200 Hz. (C) TRF1-Telomer-Wechselwirkungen wurden in Force-Jump-Assays mit einer TRF1-Konzentration von 10 nM untersucht. (D) Dissoziationskinetik von TRF1-Telomerkomplexen. Der Logarithmus der Dissoziationsrate bei getesteten Kräften (Mittelwert ± SD, n = 206) folgt dem Kramer-Bell-Evans-Modell (rote Kurve und Legendengleichung). Der Einschub zeigt die durchschnittliche Dissoziationszeit (&lt;τ&gt;) bei Ftest. (E) Verteilung der Änderungen der Ausdehnung (ΔL) bei Bruchereignissen von TRF1-Telomerkomplexen. Schwarze und rote Kurven stellen Gaußsche Beschläge dar. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Li et al.41 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg"> Abbildung 6: Die Anzahl und Größe der DNA-Schleifen, die von TRF1 in einem Telomer gebildet werden. (A) Telomerlängenabhängigkeit der DNA-Schleifengrößen (ΔL) bei [TRF1] = 20 nM. Kurven stellen Gaußsche Formstücke dar. (B) Telomerlängenabhängigkeit von ΔL bei [TRF1] = 40 nM. (C) Korrelation zwischen ΔL und der Anzahl der Rupturereignisse pro Telomer, N. Die Korrelation nullter Ordnung beträgt r = -0,20, wobei p 0,001 &lt; (Stichprobenumfang = 1496). (D) Eine Karikatur, die einen möglichen Mechanismus zur Erklärung der negativen Korrelation zwischen ΔL und N veranschaulicht, was darauf hindeutet, dass TRF1 ein einzelnes Telomer mit primären Schleifendomänen zu einer Topologie höherer Ordnung verdichten kann. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Li et al.41 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: MatLab-Code zur Generierung von scripts.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 2: Skript für konstante Kraft assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Skript für Force Ramp assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Rezepte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Analyse telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Biochemie

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