Name: Optimierung der Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay der Newcastle-Disease-Virus-Serologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Lernen Sie die optimierte Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay bei Newcastle-Disease-Virus-Serologie. Diese Methode verbessert die Antikörperdetektion und unterstützt die Geflügelgesundheitsüberwachung.

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Die Genehmigung für das Protokoll wurde vom örtlichen institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung erteilt. Alle Verfahren mit lebenden Virusantigenen und klinischen Serumproben wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 in Übereinstimmung mit den festgelegten Sicherheitsprotokollen durchgeführt.
1. Zubereitung von 1% Hühner-RBC-Suspension
<ol>
	<li>Geben Sie 3 mL Alserver-Lösung (Antikoagulans) in ein steriles konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Entnehmen Sie 1 ml Blut aus der Flügelvene jedes der drei nicht immunen Hühner (ohne NDV-Antikörper). Übertragen Sie das Blut sofort in das Röhrchen mit dem Antikoagulans und mischen Sie es vorsichtig.</li>
	<li>Füllen Sie das Röhrchen mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2-7,4) auf ein Gesamtvolumen von 12 mL und mischen Sie vorsichtig. Zentrifugieren Sie bei 500 × g für 10 min mit einem horizontalen Rotor.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und die weiße Blutkörperchenschicht. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 2x, um das RBC-Pellet zu erhalten.</li>
	<li>Pipettieren Sie 1 ml des Erythrozyten-Pellets in 99 ml steriles PBS, um eine 1%ige Erythrozytensuspension herzustellen. HINWEIS: Das erforderliche Volumen der 1%igen Hühner-Erythrc-Suspension wird auf 3 ml/Platte geschätzt (25 μl/Vertiefung x 96 Vertiefungen x 1,25 = 3,0 ml; wobei 1,25 die Pipettierverschwendung berücksichtigt, um ein ausreichendes Volumen zu gewährleisten).</li>
</ol>
2. Rekonstitution von lyophilisiertem Antigen oder Serum
<ol>
	<li>Geben Sie 2 ml steriles PBS in die Ampulle, die das lyophilisierte Antigen oder Serum enthält. Schütteln Sie die Ampulle vorsichtig und lassen Sie sie 2-3 Minuten stehen, um Blasen zu minimieren und eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. HINWEIS: Befolgen Sie die spezifischen Anweisungen des Herstellers, da die verschiedenen Arten von lyophilisierten Materialien in dieser Studie nicht verglichen wurden.</li>
	<li>Die rekonstituierte Lösung wird in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C eingefroren. HINWEIS: Bestimmen Sie den HA-Titer jedes Mal neu, wenn das Antigen aufgetaut und verwendet wird oder wenn eine neue Erythrozytensuspension hergestellt wird.</li>
</ol>
3. HA-Titration von Antigenen
<ol>
	<li>Dispensieren Sie 40, 80, 120 bzw. 160 μl PBS in vier benachbarte Vertiefungen einer Einweg-96-Well-Mikrotiterplatte mit V-Boden, fügen Sie dann 20 μl Antigen in jede Vertiefung hinzu und mischen Sie, indem Sie 10x auf und ab pipettieren, um Verdünnungen von 1:3, 1:5, 1:7 bzw. 1:9 zu erreichen. Ein schematisches Diagramm des Verdünnungsvorgangs ist in Abbildung 1 dargestellt.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Verfahrens zur Verdünnung der Antigenlösung im Hämagglutinationsassay. Die Antigenlösung wird in PBS im Verhältnis 1:3, 1:5, 1:7 bzw. 1:9 verdünnt. PBS in Vertiefungen oder Zentrifugenröhrchen ist blau dargestellt, während Antigene in grün dargestellt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2">
	<li>Beschriften Sie eine neue Mikrotiterplatte. Geben Sie 25 μl PBS in jede Vertiefung in den Reihen 1-5.</li>
	<li>25 μl der verdünnten Antigenlösungen mit einer Mehrkanalpipette in die ersten Vertiefungen der Reihen 1 bis 5 geben und durch Auf- und Abpipettieren mindestens 5x mischen.</li>
	<li>Übertragen Sie 25 μl aus der ersten Vertiefung jeder Reihe in die zweite Vertiefung und mischen Sie sie gründlich. Fahren Sie mit dem Transfer von einer Vertiefung zur nächsten bis zur 11. Säule fort, um zweifache serielle Verdünnungen (1:2 bis 1:2048) zu erzeugen. 25 μl nach der 11. Spalte verwerfen.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl PBS in jede Vertiefung, beginnend mit der Vertiefung mit der niedrigsten Antigenkonzentration.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl 1%ige Hühner-RBC-Suspension in jede Vertiefung, beginnend mit den Vertiefungen mit der niedrigsten Antigenkonzentration.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platte auf einem Mikroplatten-Shaker für ~20 s, um sie gründlich zu mischen.</li>
	<li>Lassen Sie es ungestört auf der Tischplatte bei Raumtemperatur (20-25 °C) für ~30 min, bis sich die RBC der 12. Säule vollständig abgesetzt haben. Für das Plattenlayout siehe Abbildung 2.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Schematischer Aufbau einer Mikroplatte, die im Hämagglutinationsassay verwendet wird. Die erste Spalte der Zeilen 1-5 enthält unverdünnte und verschiedene Anfangsverdünnungen der Antigenlösung, gefolgt von einer zweifachen seriellen Verdünnung von links nach rechts bis Spalte 11. Das PBS-Steuerelement wird in der letzten Spalte platziert. Der Gradient von dunkel nach hell deutet auf eine abnehmende Antigenkonzentration hin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="9">
	<li>Lesen und notieren Sie die Ergebnisse. HA wird bestimmt, indem die Platte um 90° für ~25 s gekippt wird und das Vorhandensein oder Fehlen von tränenförmigen Strömungen der Erythrozyten beobachtet wird. Die höchste Verdünnung mit vollständiger Hämagglutination (kein Strömen) entspricht 1 HA-Einheit. Vertiefungen in der 12. Spalte dienen als RBC-Kontrollen (Negativkontrolle).</li>
	<li>Berechnen Sie den HA-Titer jeder Reihe anhand von Tabelle 1, deren Maximum für die Herstellung der 4-HAU-Antigenlösung verwendet wird. Wenn z. B. a, b, c, d und e gleich 9, 8, 7, 6, 6 sind, dann ist 3 x 28 = 768 der Maximalwert und der HA-Titer des Antigenbestands.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antigene</td>
			<td>Säule mit der höchsten Verdünnung von kompletter HA</td>
			<td>HA-Titer der unverwässerten Aktien</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unverwässerte Aktien</td>
			<td>ein</td>
			<td>2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-fache Verdünnung</td>
			<td>b</td>
			<td>3 x 2B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fache Verdünnung</td>
			<td>c</td>
			<td>5 x 2cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-fache Verdünnung</td>
			<td>d</td>
			<td>7 x 2d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-fache Verdünnung</td>
			<td>e</td>
			<td>9 x 2e</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Ergebnisse des HA-Assays und Berechnung des HA-Titers der Stammlösung.
4. Herstellung der 4-HAU-Antigenlösung
<ol>
	<li>Berechnen Sie den Verdünnungsfaktor für die Herstellung der 4-HAU-Antigenlösung: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/67256/67256eq3.jpg">. Bestimmen Sie das insgesamt benötigte 4-HAU-Volumen: V = 3 ml x Anzahl der Mikrotiterplatten. Berechnen Sie dann die erforderlichen Volumina der Antigen-Stammlösung: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/67256/67256eq5.jpg">und PBS: Vp = V - Va. HINWEIS: Die Volumina werden in Millilitern gemessen. Schätzen Sie 3 mL pro Mikrotiterplatte des 4-HAU (25 μl/Vertiefung x 96 Vertiefungen x 1,25 = 3 ml).</li>
	<li>Pipettieren Sie das berechnete PBS-Volumen in einen Behälter, fügen Sie dann das entsprechende Volumen der Antigen-Stammlösung hinzu und mischen Sie gut, um die 4-HAU-Antigenlösung zu erhalten. HINWEIS: Die 4-HAU-Antigenlösung sollte so bald wie möglich verwendet werden.</li>
</ol>
5. Rücktitration der 4-HAU-Antigenlösung
<ol>
	<li>Dispensieren Sie 25, 50, 75, 100, 125 und 150 μl PBS in sechs benachbarte Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, fügen Sie dann 25 μl der 4-HAU-Antigenlösung in jede Vertiefung hinzu und mischen Sie, indem Sie 10x auf und ab pipettieren. HINWEIS: Verdünnen Sie die 4-HAU-Antigenlösung mit PBS in Verdünnungen von 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 und 1:7. Ein schematisches Diagramm des Verdünnungsvorgangs ist in Abbildung 3 dargestellt.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Verdünnungsverfahrens der Lösung von 4 Hämagglutinationseinheiten bei der Rücktitration. Die 4-HAU-Arbeitslösung wird mit PBS im Verhältnis 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 und 1:7 verdünnt. PBS ist in Blau und Antigene in Grün dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2">
	<li>Übertragen Sie 25 μl jeder verdünnten Antigenlösung mit einer Mehrkanalpipette in die Vertiefungen einer anderen Reihe. Geben Sie 25 μl PBS als Negativkontrolle in eine zusätzliche Vertiefung.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl PBS in jede Vertiefung und fügen Sie dann 25 μl 1 % Hühnerfleisch in jede Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platte auf einem Mikroplatten-Shaker für ~20 s zum Mischen.</li>
	<li>Lassen Sie es ungestört bei Raumtemperatur (20-25 °C) für ~30 min, bis sich die Erythrozyten der Negativkontrolle vollständig abgesetzt haben.</li>
	<li>Lesen und notieren Sie die Ergebnisse. HINWEIS: Die Vertiefung der Negativkontrolle sollte keine HA anzeigen. Im Idealfall ist die 1:4-Verdünnung genau die höchste Verdünnung mit vollständiger HA. Wenn der Titer der 4-HAU-Lösung mehr als 4 beträgt, kann die höchste Verdünnung 1:5, 1:6 oder 1:7 betragen; Wenn weniger, kann es 1:2 oder 1:3 sein. Ein schematischer Aufbau der Rücktitration und repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Schematische Anordnung der Vertiefungen für die Rücktitration und repräsentatives Ergebnis. Die verdünnte 4-HAU-Arbeitslösung wird in eine neue Reihe überführt, wobei eine zusätzliche PBS-Steuerung hinzugefügt wird. Der Gradient von dunkel zu hellgrün zeigt die Antigenkonzentration von hoch nach niedrig an. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die 1:4-Verdünnung die höchste Verdünnung ist, die eine vollständige Hämagglutination zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="7">
	<li>Passen Sie die 4-HAU-Antigenlösung bei Bedarf an oder formulieren Sie sie neu. HINWEIS: Wenn das Volumen der 4-HAU-Antigenlösung, die bei der Rücktitration verwendet wird, ≤1 % des Gesamtvolumens beträgt (das Volumen der 4-HAU-Antigenlösung ≥ 15 ml), finden Sie in Tabelle 2 spezifische Anpassungen. Wenn beispielsweise die höchste Verdünnung mit vollständiger HA 1:2 beträgt, beträgt der Titer der 4-HAU-Antigenlösung nun 2, und es sollte das gleiche Volumen Antigen hinzugefügt werden wie bei der vorherigen Herstellung der 4-HAU-Antigenlösung. Umgekehrt, wenn die höchste Verdünnung der vollständigen HA 1:6 beträgt, beträgt der Titer jetzt 6, und die Hälfte des PBS-Volumens sollte wieder aufgefüllt werden. Wenn das für die Rücktitration verwendete Volumen 1 % des Gesamtvolumens (das Volumen der 4-HAU-Antigenlösung &lt; 15 ml) übersteigt, wird die 4-HAU-Antigenlösung unter Verwendung des korrigierten Verdünnungsfaktors neu formuliert. Die spezifischen Korrekturen finden Sie in Tabelle 3 . Wenn beispielsweise die höchste Verdünnung der vollständigen HA 1:2 beträgt, beträgt der Titer der 4-HAU-Antigenlösung jetzt 2 und der Verdünnungsfaktor sollte auf 1/2 des Originals angepasst werden. Beträgt die höchste Verdünnung der vollständigen HA hingegen 1:6, beträgt der Titer der 4-HAU-Antigenlösung nun 6, und der Verdünnungsfaktor wird auf 3/2 des Originals eingestellt.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HA-Titer der Rücktitration</td>
			<td>Auffüllung von Antigen oder PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:2</td>
			<td>Va</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:3</td>
			<td>VA/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:5</td>
			<td>Vp/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:6</td>
			<td>Vp/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:7</td>
			<td>3Vp/4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Referenztabelle zur Anpassung der 4-HAU-Konzentration auf der Grundlage der Rücktitrationsergebnisse. Va und Vp repräsentieren die Volumina an Antigen und PBS, die bei der Formulierung der 4-HAU-Antigenlösung verwendet werden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HA-Titer der Rücktitration</td>
			<td>Korrektur des Verdünnungsfaktors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:2</td>
			<td>D/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:3</td>
			<td>3D/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:5</td>
			<td>5T/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:6</td>
			<td>3D/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:7</td>
			<td>7T/4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3: Referenztabelle der Verdünnungsfaktorkorrektur für die erneute Aufbereitung des 4-HAU-Antigens. D steht für den Verdünnungsfaktor, der zuvor bei der Herstellung von 4-HAU-Antigenen verwendet wurde.
6. Zubereitung des Serums
<ol>
	<li>Sammeln Sie ~1 ml Blut aus Hühnerflügeln, ohne ein Antikoagulans zu verwenden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Blut in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und inkubieren Sie es bei 37 °C für ~2 h. Bei 3.000 x g für 10 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen ansaugen.</li>
</ol>
7. HI-Assay
<ol>
	<li>Markieren Sie Mikrotiterplatten entsprechend dem Assay-Layout. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 μl PBS in jede Vertiefung in den Spalten 1-11 und 50 μl in die Vertiefungen in Spalte 12.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl Serum in die erste Vertiefung jeder Reihe, einschließlich positiver und negativer Serumkontrollreihen. Mischen Sie gründlich, indem Sie mindestens 5x auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 25 μl aus der ersten Vertiefung jeder Reihe in die zweite Vertiefung und mischen Sie sie gründlich. Fahren Sie mit dem Übertragen und Mischen von der zweiten Vertiefung in die dritte Vertiefung usw. fort, bis zur 10. Spalte. 25 μl Flüssigkeit aus der Vertiefung in der 10. Säule nach dem Mischen verwerfen.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl 4-HAU-Antigen in jede Vertiefung in den Spalten 1-11 in Richtung einer niedrigen bis hohen Serumkonzentration.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platte auf einem Mikrotiterplatten-Shaker für ~20 s. Lassen Sie es für ~30 min ungestört auf der Arbeitsplatte.</li>
	<li>Geben Sie 25 μl 1 % Hühner-Erythrozyten in jede Vertiefung in Richtung einer niedrigen bis hohen Serumkonzentration.</li>
	<li>Schütteln Sie die Platte auf einem Mikroplatten-Shaker für ~20 s, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie es ~30 min lang ungestört auf dem Labortisch, bis sich die Erythrozyten der PBS-Kontrollwellen vollständig abgesetzt haben.</li>
	<li>Lesen und notieren Sie die Ergebnisse. HINWEIS: Der HI-Titer ist die höchste Serumverdünnung, die die Hämagglutination des 4-HAU-Antigens vollständig hemmt. Eine tränenförmige Strömung von Erythrozyten kann in der letzten Spalte jeder Reihe beobachtet werden, indem die Platte um 25 s um 90° gekippt wird. Vollständiges HA (kein Streaming) kann in der vorletzten Vertiefung ab dem Ende jeder Reihe beobachtet werden. Gültige Testergebnisse setzen voraus, dass der HI-Titer der positiven Serumkontrolle innerhalb einer Verdünnung des bekannten HI-Titers liegt; der HI-Titer der negativen Serumkontrolle muss ≤ 2 log2 betragen; und das Fehlen von Selbst-HA der RBC-Kontrolle. Ein schematisches Diagramm des Arbeitsablaufs des HA-Assays finden Sie in Abbildung 5.</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs des Hämagglutinationsassays. PBS ist in blau, Serum in gelb, die 4-HAU-Antigenlösung in grün und die 1%ige Hühner-Erythrozyten-Suspension in rot dargestellt. Pfeile zeigen die Reihenfolge der Flüssigkeitsabgabe an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierte Vorbereitung von 4-HAU-Antigen für den präzisen Nachweis von NDV-Antikörpern

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</ol>

Die in diesem Artikel vorgeschlagene optimierte Methode stellt einen Ansatz zur genauen Herstellung der 4-HAU-Antigenlösung dar. Die OIE- und EU-Leitlinien schlagen zwar anfängliche Verdünnungen für die HA-Titration vor, enthalten jedoch keine genauen Angaben zu den zu verwendenden Verdünnungsverhältnissen und bieten keine spezifischen Methoden an11,12. Darüber hinaus empfehlen die FAO und die OIE zwar die Rücktitration als Mittel zur Verbesserung der Genauigkeit von 4-HAU, aber es f...

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Steriles Zentrifugenröhrchen (15 mL)</td><td>Labshark</td><td>130201030</td><td></td></tr><tr><td>Luftgekühlte Tischzentrifuge mit niedriger Drehzahl&nbsp;</td><td>Titan</td><td>LDC-5</td><td></td></tr><tr><td>Alserve's Solution</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607058</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>DLAB</td><td>9032002121</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteur-Pipette</td><td>Titan</td><td>SWXG-004</td><td></td></tr><tr><td>sterile Einwegspritze (1 ml)</td><td>Beyotime</td><td>FS801-30PCS</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Mikrotiterplatte mit V-Boden (96-Well)</td><td>Labshark</td><td></td><td></td>130207001</tr><tr><td>Mikrotiterplattenschüttler</td><td>Jiangsu Xinkang Medical Equipment Co., Ltd</td><td>XK96-3</td><td></td></tr><tr><td>NDV HI Negatives Sera</td><td>Qingdao Regen Diagnostics Entwicklungszentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NDV HI Positives Sera</td><td>Qingdao Regen Diagnostics Entwicklungszentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NDV HI Test Antigen</td><td>Qingdao Regen Diagnostics Entwicklungszentrum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS Lösung (1x)&nbsp;</td><td>Adamas Life</td><td>C8020</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Zentrifugenröhrchen (1,5 mL)</td><td>Labshark</td><td>130201012</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierung der antigenpräparation für den hämagglutinationshemmungsassay der newcastle-disease-virus-serologie

Optimization of Antigen Preparation for Hemagglutination Inhibition Assay of Newcastle Disease Virus Serology

Validierung des Titers der 4-HAU-Antigenlösung, die nach der optimierten Methode formuliert wurde In der Studie wurden verschiedene Verdünnungen der Antigen-Stammlösung verwendet, um den HA-Titer genau zu bestimmen und die Berechnung des Verdünnungsfaktors für die Herstellung der 4-HAU-Antigenlösung zu erleichtern. Die Ergebnisse zeigen, dass die optimierte Methode sowohl effizient als auch präzise ist und die Anzahl der sich wiederholenden Rücktitrations- und Anpassungsverfahren reduziert. Im ersten ...

Optimierung der Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay der Newcastle-Disease-Virus-Serologie

Accurate assessment of Newcastle disease virus (NDV) antibody titers is crucial for effective poultry disease control and surveillance. This article ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Video zeigt einen Hämagglutinations-Inhibitions-Assay zum Nachweis von Serum-Antikörpern gegen spezifische Antigene. Die Bestätigung der Hämagglutinationshemmung in der Testvertiefung und der Hämagglutination in der Kontrollvertiefung wird durch unterschiedliche visuelle Muster erreicht. Dieser Assay spielt eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Immunantwort, der Wirksamkeit von Impfstoffen und der Untersuchung von Virusinfektionen in der Virologie und Immunologie.

Der Hämagglutinationshemmungsassay zum Nachweis von Serumantikörpern gegen ein Zielantigen

Dieses Video zeigt Mikroneutralisationsassays zur Messung neutralisierender Antikörper mit Hilfe von Madin-Darby Canine Kidney Zellen, die α2,6-verknüpfte Sialinsäure in menschlichen Seren überexprimieren. Dieser Assay wird häufig in der Influenza-Humanserologie...

Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Influenza-Neuraminidase (NA) misst, die die Antikörpertiter in einer Serumprobe hemmt. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen NA enthält, wird auf eine mit Fetuin beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Nach Zugabe des Virus verhindern die Antikörper, dass virale NA Fetuin spaltet und seine Galaktose-Einheit freilegt. Anschließend wird ein Peroxidase-konjugiertes Lektin zugegeben, das an die exponierte Galaktose bindet. Der NA-hemmende Antikörpertiter wird...

Ein Assay zur Messung von Antikörpertitern zur Influenza-Neuraminidase-Hemmung

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Wir beschreiben den Enzyme-linked Lectin Assay (ELLA) zur Messung von Influenza-Neuraminidase (NA)-Inhibitions-Antikörpertitern in Seren. Der Assay verwendet Erdnuss-Agglutinin, um Galaktose-Rückstände zu quantifizieren, die zugänglich werden, wenn NA Sialinsäure von Fetuin-beschichteten 96-Well-Platten entfernt.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Die vorgestellten Protokolle wird beschrieben, wie einen Hämagglutination Inhibition Assay Quantifizierung des Influenza-spezifischen Antikörper-Titer von Serumproben von Grippe-Impfstoff Empfängern durchführen. Der erste Test bestimmt optimale virale Antigen-Konzentrationen durch Hämagglutination. Die zweite Probe quantifiziert Influenza-spezifischen Antikörper-Titer Hämagglutination Inhibition.

Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg &gt; 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Wir beschreiben eine Methode zur Prozess-und Screen-Bereich gesammelt Mücken für eine Vielzahl von Viren durch Vero-Zellkultur-Assay. Durch den Einsatz dieser Technik haben wir 9 verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien erkannt in Mücken in Connecticut gesammelt.

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Lernen Sie die optimierte Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay bei Newcastle-Disease-Virus-Serologie. Diese Methode verbessert die Antikörperdetektion und unterstützt die Geflügelgesundheitsüberwachung.

Optimierung der Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay der Newcastle-Disease-Virus-Serologie

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