Optimierung der Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay der Newcastle-Disease-Virus-Serologie

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Optimierung der Antigenvorbereitung für die Hämagglutinationshemmungsassays. Um die Genauigkeit des Nachweises von NDV-Antikörpern zu verbessern, stellen wir eine Methode zur schnellen und genauen Vorbereitung der 4-HAU-Antigenlösung zur Verfügung. Der HI-Assay ist nach wie vor die gebräuchlichste Methode zum Nachweis von NDV-Antikörpern.

Aber auch neue Technologien, darunter automatisierte Liquid-Handling-Systeme, serologische Hochdurchsatz-Plattformen und die fortschrittlichen Bildgebungswerkzeuge, können in den HI-Assay integriert werden. Sie ermöglichen eine schnellere und genauere Analyse, insbesondere bei großen Losgrößen. Wir haben eine effiziente Methode für einen genaueren Nachweis der HA-Titer von Antigenstammlösung etabliert, kombiniert mit einer rigorosen Rücktitrationsmethode und einem genau definierten Anpassungsprozess.

Dieser Ansatz bietet eine genaue Methode und minimiert den Rechenaufwand, erhöht die Effizienz und Zuverlässigkeit der Tests und trägt zu einer verbesserten Krankheitsüberwachung und -kontrolle in Geflügelpopulationen bei. Die Suspension der roten Blutkörperchen von Hühnern und die visuelle Anzeige der HA HI-Ergebnisse tragen immer noch zur Variabilität bei. Unser Labor wird sich auf die Standardisierung der Erythrozytensuspension und die Erforschung von Computer Vision oder anderen Methoden zur Digitalisierung der HA HI-Testergebnisse konzentrieren, um die Subjektivität zu reduzieren und die Konsistenz zu verbessern.

Geben Sie zunächst drei Milliliter Alserver-Lösung in ein steriles konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Millilitern. Sammeln Sie einen Milliliter Blut aus der Flügelvene jedes der drei nicht immunen Hühner. Übertragen Sie dann sofort das gesammelte Blut in das Antikoagulansröhrchen und mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Inversion.

Füllen Sie das Röhrchen mit sterilem PBS, um das Gesamtvolumen auf 12 Milliliter zu bringen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Komponenten zu gewährleisten. Legen Sie dann das Röhrchen in eine Zentrifuge, die mit einem horizontalen Rotor ausgestattet ist, und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 500 g.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand und die weiße Blutkörperchenschicht aus dem Röhrchen. Pipettieren Sie mit einer Pipette einen Milliliter des RBC-Pellets in 99 Milliliter sterile PBS-Lösung, um eine 1%ige RBC-Suspension herzustellen. Um das lyophilisierte Antigen zu rekonstituieren, geben Sie zwei Milliliter steriles PBS in die Ampulle, die es enthält.

Schütteln Sie die Ampulle vorsichtig, um den Inhalt vollständig aufzulösen, und lassen Sie sie zwei bis drei Minuten stehen, um die Blasenbildung zu minimieren. Aliquot rekonstituierte Lösung in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lagert sie bis zur Verwendung in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Geben Sie zunächst 40, 80, 120 bzw. 160 Mikroliter PBS in vier benachbarte Vertiefungen einer Einweg-96-Well-Mikrotiterplatte mit V-Boden.

Geben Sie 20 Mikroliter des rekonstituierten Antigens in jede Vertiefung und pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um eine Verdünnung zu erzielen. Beschriften Sie dann eine neue Mikrotiterplatte deutlich für die nachfolgenden Schritte und geben Sie 25 Mikroliter PBS in jeder Vertiefung in den Reihen eins bis fünf ab. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter der verdünnten Antigenlösungen in die ersten Vertiefungen der Reihen eins bis fünf.

Pipettieren Sie den Inhalt mindestens fünfmal auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Übertragen Sie dann 25 Mikroliter aus der ersten Vertiefung jeder Reihe in die zweite Vertiefung und mischen Sie sie gründlich. Entsorgen Sie 25 Mikroliter der endgültigen Lösung nach der 11. Spalte.

Geben Sie anschließend 25 Mikroliter PBS bzw. 1 % Hühner-RBC-Suspension in jede Vertiefung, beginnend mit den Vertiefungen mit der niedrigsten Antigenkonzentration. Legen Sie die Mikrotiterplatte auf den Mikrotiterplattenschüttler, um sie gründlich zu mischen. Lassen Sie die Platte ca. 30 Minuten lang ungestört bei Raumtemperatur auf der Tischplatte, damit sich die Erythrozyten in der 12. Säule vollständig absetzen können.

Berechnen Sie den Verdünnungsfaktor für die Herstellung der 4-HAU-Antigenlösung nach der hier gezeigten Formel. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen der benötigten 4-HAU-Lösung und die erforderlichen Volumina der Antigen-Stammlösung und des PBS unter Verwendung der angegebenen Formel. Übertragen Sie mit einer Pipette das berechnete PBS-Volumen in einen Behälter.

Geben Sie das entsprechende Volumen der Antigen-Stammlösung hinzu und mischen Sie gründlich, um die 4-HAU-Antigenlösung herzustellen. Geben Sie dann 25, 50, 75, 100, 125 und 150 Mikroliter PBS in sechs benachbarte Vertiefungen einer Mikrotiterplatte ab. Geben Sie 25 Mikroliter der 4-HAU-Antigenlösung in jede Vertiefung und pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um eine ordnungsgemäße Verdünnung zu gewährleisten.

Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter jeder verdünnten Antigenlösung aus der ersten Reihe in die Vertiefungen einer anderen Reihe. Geben Sie dann 25 Mikroliter PBS in jede Vertiefung, gefolgt von 25 Mikrolitern einer 1%igen Hühner-RBC-Suspension in jeder Vertiefung. Stellen Sie die Platte für ca. 20 Sekunden auf einen Mikrotiterplatten-Shaker, um den Inhalt gründlich zu mischen.

Beobachten Sie sorgfältig die Hämagglutinationsmuster in den Vertiefungen und notieren Sie die Ergebnisse.