Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Wir haben eine Echtzeit-Mikroskopie-Methode zur Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) entwickelt. Diese NETs spielen eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunabwehr. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Akkumulation von NETs in Geweben zur Pathophysiologie mehrerer Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen beiträgt.

Aufgrund der pathologischen Implikationen von NETs ist das Interesse an der Entwicklung von NETosis-Antagonisten gestiegen. Um die NETosis-Hemmung zu untersuchen, haben wir eine Echtzeit-Mikroskopie-Methode zur Quantifizierung der menschlichen NET-Freisetzung entwickelt, die es uns ermöglicht, NETosis und seine Hemmung im Hochdurchsatz zu untersuchen. Neutrophile Zellen sind empfindliche Zellen und können ihre Reaktionsfähigkeit auf Reize während des Reinigungsprozesses aufgrund von mechanischem, mikrobiellem und anderen Stress verändern.

Daher ist es wichtig, das Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen zu validieren, um die Aktivierung von Neutrophilen zu minimieren. Diese Technik ermöglicht also die Untersuchung der NET-Freisetzung sowohl von gesunden als auch von kranken Personen. Darüber hinaus ermöglicht es uns, die Kinetik der NET-Bildung zu untersuchen, die durch verschiedene physiologische Reize induziert wird.

Mit dieser Hochdurchsatz-Mikroskopietechnik konnten wir zeigen, dass der NETiosis-Antagonist CIT-013, ein monoklonaler Antikörper, der auf die citrullinierten Histone 2A und 4 abzielt, in der Lage ist, die NET-Freisetzung mit einem IC 50 oder 4,6 Nanomolar effizient zu hemmen. Dies zeigt, dass dieser Assay für die Untersuchung von NETosis-Antagonisten geeignet ist. Nachdem Sie dem gesunden Freiwilligen peripheres Blut in einem Lithium-Heparin-Röhrchen entnommen haben, übertragen Sie das Blut in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie das Lithium-Heparin-Röhrchen mit DPBS und übertragen Sie es in dasselbe 50-Milliliter-Röhrchen, wobei Sie sicherstellen, dass das Verhältnis von Blut zu DPBS 1:1 beträgt. Nach dem Mischen verdünntes Blut auf die Dichtegradientenlösung geben. Zentrifugieren Sie das Blut bei 400 g für 40 Minuten mit minimaler Beschleunigung und Pause.

Entsorgen Sie die oberste Plasmaschicht mit einer 10-Milliliter-Pipette. Verwenden Sie dann eine Pasteurpipette aus Kunststoff, um die mononukleären Zellen des peripheren Blutes und die Dichtegradientenlösung zu verwerfen. Schütteln Sie die Schicht, die Erythrozyten und Neutrophile enthält, vorsichtig, bevor Sie sie in 15 Millilitern DPBS wieder suspendieren.

Fügen Sie 25 Milliliter 6%iges Dextran und 0,9%ige Natriumchloridlösung hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Nach 25 Minuten Inkubation wird die oberste Neutrophilenschicht mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Dekantieren Sie das Röhrchen, um den Überstand zu entsorgen, und suspendieren Sie das Pellet erneut in 10 Millilitern Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer.

Fügen Sie 40 Milliliter desselben Lysepuffers hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur, während Sie das Röhrchen kontinuierlich umdrehen, bis die Lösung durchscheinend wird. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 350 g für 10 Minuten. Nach dem Entfernen des Überstands werden langsam und tropfenweise fünf Milliliter Nährmedium zu 10 % auf das Neutrophilenpellet gegeben, ohne die Neutrophilen in Suspension zu bringen.

Schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, bis die meisten Erythrozyten, die sich auf dem Neutrophilenpellet befinden, wieder im Nährmedium suspendiert sind. Nach Entfernen des Überstands das Neutrophilenpellet in 10 Millilitern Kulturmedium 10 % erneut suspendieren. Sobald es vollständig resuspendiert ist, fügen Sie bis zu 50 Milliliter Kulturmedium 10 % hinzu und zentrifugieren Sie die Mischung, bevor Sie das Pellet in 10 Millilitern Neutrophil Extracellular Trap oder NET-Assay-Puffer erneut suspendieren. Geben Sie zunächst 0,001 %ige Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 200 Mikrolitern DPBS und trocknen Sie die Vertiefungen an der Luft. Als nächstes resuspendieren Sie die erforderliche Anzahl von Neutrophilen in der extrazellulären Neutrophilenfalle oder im NET-Assay-Puffer. Übertragen Sie den vierfach konzentrierten DNA-Farbstoff in einem NET-Assay-Puffer in jede Vertiefung.

Geben Sie vierfach konzentrierte NETosis-Stimuli in NET-Assay-Puffer in die entsprechenden Vertiefungen. Geben Sie dann vierfach konzentrierte NETosis-Antagonisten in NET-Assay-Puffer und Neutrophilensuspension in die entsprechenden Vertiefungen. Die Platte bei 100 g zwei Minuten lang zentrifugieren.

Setzen Sie dann die Platte in das Analysesystem für Lebendzellen ein, das in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid aufgestellt wird. Nachdem Sie die 96-Well-Speicherfolie mit der Neutrophilensuspension in ein Lebendzellmikroskopie-Analysesystem eingesetzt haben, öffnen Sie die Systemsoftware. Klicken Sie auf Zeitplan, um zu erwerben, und klicken Sie auf die Plus-Schaltfläche, um zu starten.

Wählen Sie dann "Nach Zeitplan scannen" und klicken Sie auf "Weiter". Um ein neues Gefäß von Grund auf neu zu erstellen, wählen Sie im Abschnitt "Gefäß erstellen" die Option "Neu" aus und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie im Abschnitt Scantyp die Option Standard aus, und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie die Scan-Einstellungen als Zelle für Zelle, keine aus. Bildkanäle, Phasenkontrast in grün. Erfassungszeit, 100 Millisekunden und Objektiv 20x.

Klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie im Abschnitt "Gefäßauswahl" den entsprechenden Behältertyp aus, den Sie scannen möchten, und klicken Sie auf "Weiter". Geben Sie den Speicherort in der Schublade für das Gefäß an, und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie im Abschnitt Scanmuster die Wells aus, die gescannt werden müssen, und die Anzahl der Bilder pro Well. Klicken Sie auf Weiter. Geben Sie im Abschnitt Schiffsnotizbuch Informationen über das Schiff an.

Geben Sie den Namen des Blechs ein, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie im Abschnitt Analyseeinrichtung die Option Analyse auf später verschieben aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie im Abschnitt Scan-Zeitplan die Option Neuen Zeitplan mit Scans in Intervallen erstellen aus, und wählen Sie im Abschnitt Scans zum Zeitplan hinzufügen die Option Eine Stunde aus.

Wählen Sie Scanvorgang fünf Stunden nach dem ersten Scan stoppen aus. Klicken Sie auf Weiter und dann auf Hinzufügen, um zu planen, wann die Scaninformationen korrekt sind. Nachdem Sie Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzbilder von Neutrophilen aufgenommen haben, starten Sie die Software zur Analyse der Lebendzellmikroskopie.

Wählen Sie in der Ansicht das zu analysierende Lebendzellmikroskopie-Experiment aus. Wählen Sie Neue Analysedefinition erstellen aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie dann im Abschnitt Analysetyp die Option Basisanalysator aus, und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie im Abschnitt "Bildkanal" die Option "Grün" aus, deaktivieren Sie die Option "Phase" und klicken Sie auf "Weiter". Öffnen Sie das Fenster mit den Bildebenen, wählen Sie Grün und deaktivieren Sie die Phase. Deaktivieren Sie die automatische Skalierung im grünen Bereich und legen Sie Min und Max manuell fest.

Öffnen Sie dann das Fenster für die Scanzeiten des Schiffes und wählen Sie die Bilder aus, die positive Kontrollwells mit NETs darstellen. Öffnen Sie das Fenster mit den Einstellungen für die Analysedefinition, und schreiben Sie NETs für den Objektnamen. Wählen Sie für die Segmentierung Adaptiv aus.

Wählen Sie für den Schwellenwert GCU zwischen drei und fünf aus, und legen Sie die Kantenteilung Ein zwischen minus 10 und null fest. Wählen Sie als Nächstes für die Bereinigung die Option Lochfüllung auf 100 Quadratmikrometer aus, und passen Sie die Größe auf minus ein Pixel an. Wählen Sie unter Filter die Option Bereich größer als 200 Quadratmikrometer, mittlere Intensität kleiner als 24,6 und integrierte Intensität größer als 7.000 aus.

Klicken Sie dann auf Vorschau aktuell oder Vorschau aller Vorschau, um die Einstellungen zu übernehmen. Zeigen Sie mit der Maus auf die verschiedenen NET-Strukturen, und passen Sie die Analyseeinstellungen an, um die falsch positiven und falsch negativen NETs zu optimieren. Wenn die Einstellungen für die NET-Analyse korrekt sind, klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie die zu analysierenden Zeitpunkte und Vertiefungen im Abschnitt Scanzeiten und Vertiefung aus und klicken Sie auf Weiter. Geben Sie den Definitionsnamen in den Abschnitt Analysedefinition speichern und anwenden ein, und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie auf Fertig stellen, wenn die Analyseinformationen überprüft und korrekt sind.

Öffnen Sie die Experimentanalyse, indem Sie auf die Analyse innerhalb des gewünschten Gefäßes klicken. Öffnen Sie dann das Fenster für Diagrammmetriken. Klicken Sie anschließend auf die Plus-Schaltfläche, um eine Metrik zu erstellen.

Wenn Sie Daten als prozentuale NET-Konfluenz darstellen, wählen Sie im Abschnitt Metrik die Option Bereich und dann im Abschnitt Wert die Option Konfluenz aus. Wenn Sie Daten als Prozentsatz der NETting-Neutrophilen darstellen, wählen Sie im Abschnitt Metrik die Option Objektanzahl und im Abschnitt Wert die Option Pro Bild aus. Wählen Sie nach dem Konfigurieren der Metrikeinstellungen im Abschnitt "Benutzerdefinierte Metriken" die Option "NETs Area Confluence" oder "NETs Object Count Per Image" aus.

Wählen Sie alle erforderlichen Zeitpunkte und Vertiefungen für die Analyse in den Abschnitten "Scans auswählen" bzw. "Vertiefung auswählen" aus. Klicken Sie abschließend auf Daten exportieren. Die Stimulation von Kalzium-Ionenophoren induzierte im Vergleich zu PMA eine schnellere NETose, was zu einem höheren Anteil von Neutrophilen führte, die NETs freisetzten.

NETs, die durch Calcium-Ionophore induziert wurden, waren diffuser jenseits der neutrophilen Plasmamembran, während PMA-induzierte NETs näher an der neutrophilen Plasmamembran blieben. Ein Trend zu erhöhten NET-Spiegeln wurde beobachtet, wenn Neutrophile mit beschichteten Immunkomplexen, FMLP und Mononatriumuratkristallen aktiviert wurden. Die NET-Freisetzung als Reaktion auf ein 23187 wurde durch CIT-013 bei einer halbmaximalen Hemmkonzentration von 4,6 Nanomolar vollständig gehemmt.