Ein Protokoll für Explantatkulturen von IDH1-mutierten diffusen niedriggradigen Gliomen

In unserem Labor konzentrieren wir uns auf die seltene Art von Hirntumoren, die als diffuse niedriggradige Gliome bezeichnet werden. Diese Gliome betreffen häufig junge Erwachsene und sind durch eine Mutation im Gen namens IDH-1 gekennzeichnet. Die wichtigsten Fortschritte auf dem Gebiet der Gliome sind erstens die Verwendung von 3D-Modellen, wie Tumoroiden oder Organoiden, zweitens die Verwendung von Bildgebung direkt im Gehirn von Mäusen, denen Gliome transplantiert wurden, und drittens die Verwendung spezieller transkriptomischer und einzelliger RNA.

Die größte Herausforderung, vor der wir stehen, wenn wir an IDH-1-mutierten Gliomen arbeiten, ist die geringe Proliferation dieser Zellen und ihre Schwierigkeit, in Kultur erhalten zu werden, und dass wir ein Protokoll abgeleitet und definiert haben, um die Zellen am Leben zu erhalten, und für einige von ihnen konnten wir eine Zelllinie ableiten. aber nicht für alle Patienten. Durch die Untersuchung von IDH-1-mutierten Zellen in vitro, aber auch in vivo haben wir herausgefunden, dass diese Zellen ziemlich plastisch sind und das Schicksal zweier Zellen annehmen können, entweder astrozytenartig oder oval, und wir haben auch herausgefunden, dass Nudge eine wichtige Rolle bei dieser Plastizität spielt. Mit diesem neuen Explantatprotokoll waren wir in der Lage, die IDH-1-mutierten Zellen in vitro über Wochen, aber noch mehr über Monate zu erhalten, und wir haben gezeigt, dass es verschiedene Arten von Tumorzellen gibt, wie wir sie bei Patienten gefunden haben.

Wir haben auch herausgefunden, dass es einige Tumorumgebungszellen gibt, wie z. B. Mikrogliazellen, die es ermöglichen, die Interaktion zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung zu untersuchen, so dass diese Modelle eine genauere Darstellung der biologischen Vielfalt in den Tumoren bieten. Bereiten Sie zunächst den Arbeitsbereich vor und ordnen Sie alle sterilisierten Werkzeuge an. Übertragen Sie die Tumorresektion auf Eis, um die Lebensfähigkeit des Gewebes für die Kultur zu erhalten.

Untersuchen Sie die Tumorresektion auf Größe und Heterogenität. Wählen Sie Teile aus, die eine graue Farbe mit einer weichen oder geleeartigen Textur aufweisen, da diese Bereiche reich an Tumorzellen sind. Übertragen Sie die ausgewählten Tumorproben in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen oder Kryoröhrchen und fügen Sie ein Milliliter Medium hinzu.

Schneiden Sie die Proben mit einer sterilen Schere in kleine Stücke von ein bis zwei Kubikmillimetern. Schneiden Sie anschließend mit einer sterilen Schere das Ende einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze ab, um eine breite Öffnung mit einem Durchmesser von etwa drei bis vier Millimetern zu erhalten. Pipettieren Sie 100 bis 200 Mikroliter der zerkleinerten Gewebefragmente mit einer abgeschnittenen Spitze in Vertiefungen einer Platte.

Die Suspension vorsichtig rehomogenisieren, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, da die kleineren Fragmente dazu neigen, sich schnell abzusetzen. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit. Tauschen Sie das Medium täglich aus, wenn die Stoffwechselaktivität des Tumors eine schnelle Gelbfärbung verursacht oder wenn die Fragmentdichte dies erfordert.

Besorgen Sie sich zunächst die zerkleinerte Tumorgewebssuspension. Für die Vorbereitung des Gefriermediums geben Sie zwei Milliliter DMSO auf acht Milliliter Zellkulturmedium. Kombinieren Sie ein Volumen der zerkleinerten Tumorsuspension mit einem gleichen Volumen des vorbereiteten 20%igen DMSO-Gefriermediums.

Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig auf und ab, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten. Bringen Sie die Kryofläschchen schnell in einen kryogenen Behälter, um eine allmähliche Temperatursenkung zu ermöglichen, und inkubieren Sie dann über Nacht bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie sie zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführen. Zum Auftauen nehmen Sie die Kryofläschchen aus flüssigem Stickstoff und legen sie sofort in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Erwärmen Sie sie, bis ca. 80 % der Zellen aufgetaut sind. Um das DMSO zu entfernen, geben Sie die Suspension schnell in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das fünf Milliliter vorgewärmtes 1X PBS enthält, und zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 300 g. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die PBS-Wäsche, gefolgt von der Zentrifugation.

Saugen Sie den Überstand an und stellen Sie sicher, dass das Pellet ungestört bleibt. Resuspendieren Sie das Pellet in einer angemessenen Menge Medium und geben Sie es in eine vorbeschichtete PDL Laminin 24-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius.

Es wurde beobachtet, dass Zellen mit länglichen, bipolaren oder multipolaren Morphologien aus Tumorexplantaten wuchsen, die nach einer Mindestkulturdauer von vier Wochen an der Well-Oberfläche befestigt waren. Tumorzellen zeigten in drei Fällen eine vergleichbare Morphologie zwischen frischen und kryokonservierten Tumoren, was sich an länglichen und bipolaren Erscheinungen zeigt, die komplizierte Netzwerke bilden. Die radiale Migration der vom Tumor stammenden Zelle entlang der Faser war deutlich zu beobachten.

Erfolglose Explantatkulturen zeigten nicht-adhärente Fragmente und zahlreiche Gitterzellen, die durch Autofluoreszenz und Lipidgehalt gekennzeichnet waren.