Name: Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Erfahren Sie die optogenetische allosterische Regulation mit dem LightR-System zur präzisen Steuerung von Proteinaktivität. Diese Methode ermöglicht reversible Lichtkontrolle zellulärer Signalwege und Zellmigration in Echtzeit.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optogenetische Kontrolle der Enzymaktivität mit lichtregulierten allosterischen Schaltern

<table><tbody><tr><td>#1.5 Glas-Deckgläser 25 mm Rund</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen&nbsp;</td><td>USA Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Puffer</td><td></td><td></td><td>für 500 mL: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml Glycerin, 52,5 ml 20 % SDS, 0,5 g Bromphenolblau, endgültiger pH-Wert 6,8</td></tr><tr><td>4-20 % Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Puffer</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED Mikroskop Ringlicht</td><td>Boli Optik</td><td>ML46241324</td><td>Blaue LED, 60 mm Durchmesser, 5 W</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk 1/2 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MEK</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Paxillin-Zell-Signalweg</td><td></td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-Erk 1/2 T202/Y204</td> Antikörper-Zell-Signalweg <td></td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-pY249 p130Cas-Zell-Signalweg</td><td></td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-Y118 Paxillin-Zell-Signalweg</td><td></td><td>2541</td><td></td></tr><tr><td>Anto-Phospho-S217/221 MEK-Zelle</td><td> Signalisierung</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Compatable Power Supply</td><td>Corporate Computer</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td><td>&lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fötales Kälberserum (FBS) &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Produkte</td><td>100-106</td><td>Hitzeinaktiviert Triple 0,1 & Mikro; m sterilfiltriert&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>Geschenk von Dr. John O'Bryan, MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (Dinatrium)</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Deep Red Plasmamembranfarbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix&nbsp;</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a-kompetente Zellen&nbsp;</td><td>NEB&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Leiter&nbsp;</td><td>GoldBio&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1 Enzym&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DVB-T</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Clelands Reagenzien&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgen</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin aus Rinderplasma&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Transfektionsreagenz&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Gel Grüne Nukleinsäure-Färbung&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Farbstoff Lila 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Gel-Extraktionskit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0692</td><td>Gel-Extraktions-Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>HEK 293T Zellen&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Zellen&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Iot Relais</td><td>Digital Logger</td><td>DLI 705020645490</td><td>AC/DC Steuerrelais für Beleuchtung</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfat</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LED Grow Light System</td><td>HQRP</td> 884667106091218 <td>LED-Panel-Lampensystem&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>Software zum Ausführen von CellGEO-Skripten</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Imaging Analysis</td></tr><tr><td>Software MgCl2&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Bausatz&nbsp;</td><td>Wahl der Gene&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Fertiggele 12 Well</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Molekularbiologie Qualität Wasser&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polychroitischer Multiband-Spiegel</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca und Mg&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgen</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Geschenk aus dem Labor von Dr. Channing Der, UNC</td></tr><tr><td>PCR Röhrchen&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0,2 mL 8-Streifen-Röhrchen und -Kappen, starre Streifen, einzeln angebrachte Domkappen&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>Polygon 400 Patterned Illuminator</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>Primer&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membranen</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Filterpapier Sandwiches&nbsp;</td></tr><tr><td>T0,25% Trypsin, 2,21 mM, eDTA, 1x [-] Natrium</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetat-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>Für die Elektrophorese&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x Mikroskop Objektiv</td><td>Olympus</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL Box</td><td>National Instruments</td><td>6501</td><td>Für TTL-Schnittstelle</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

raumzeitliche steuerung der proteinaktivität durch optogenetische allosterische regulation

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

Der LightR-Src wird nach der in Abbildung 1A,B beschriebenen Strategie entworfen und generiert. Die biochemische Analyse von LightR-Src greift auf die Phosphorylierung der bekannten endogenen Src-Substrate p130Cas (Y249)22 und Paxillin (Y118)23 als Reaktion auf blaues Licht bei 60 min kontinuierlicher Beleuchtung zu (Abbildung 2B). Bemerkenswert ist, dass keine Hintergrundaktivierung der Src-Kinase beobachtet wird, wenn LightR-Src nur 16-18 Stunden nach der Transfektion in der Dunkelheit exprimiert wird. Darüber hinaus induziert die katalytisch inaktive Mutante von LightR-Src mit D388R-Mutation keine Phosphorylierung des Src-Substrats, was zeigt, dass die Phosphorylierung durch aktives LightR-Src durchgeführt wird und nicht durch einen unspezifischen Effekt der Blaulichtbeleuchtung verursacht wird (Abbildung 2B). Unter Berücksichtigung von Berichten über oszillatorische Aktivität der Src27-Kinase in lebenden Zellen untersuchten wir, ob LightR-Src so abgestimmt werden kann, dass es eine zyklische Aktivierung zeigt. Das ursprüngliche LightR-Src zeigte eine langsame Deaktivierungskinetik (Abbildung 2C), was zur Generierung einer neuen Variante, Fast-LightR-Src, führte, die die I85V-Mutation in beiden VVDs beherbergte. Abbildung 2D zeigt, dass Fast-LightR-Src eine deutlich schnellere Deaktivierungskinetik zeigt und innerhalb von 10 Minuten nach dem Ausschalten des Lichts vollständig inaktiviert wird, verglichen mit über einer Stunde bei LightR-Src. Mit FastLightR-Src konnten wir auch wiederholte Zyklen der Aktivierung/Inaktivierung erreichen (Abbildung 2E). Diese Ergebnisse zeigen zusammengenommen die Fähigkeit des LightR-Tools, eine spezifische und streng kontrollierte Regulation der Src-Aktivität in lebenden Zellen zu erreichen.
Die Anwendung von FastLightR-Src ermöglicht es auch, die Auswirkungen einer transienten Src-Aktivierung auf die Zellmorphodynamik zu bewerten. Die Aktivierung von FastLightR-Src in HeLa-Zellen induziert die Zellausbreitung, und dieser Prozess stoppt, sobald FastLightR-Src inaktiviert wird. Nach der Aktivierung beobachteten wir die Translokation von FastLightR-Src aus dem perinukleären Kompartiment zu den fokalen Adhäsionen und der Plasmamembran, ein Verhalten, das die Wildtyp-Src-Kinase11,12 zeigte. Leuchtende Zellen, die die katalytisch inaktive Mutante D388RLightR-Src exprimieren, zeigen keine solchen Ausbreitungseffekte (Abbildung 3B,C). Dies bestätigt weiter, dass FastLightR-Src ähnlich wie sein Wildtyp-Gegenstück funktioniert. Die lokale Beleuchtung einer Zellregion führt zu einer lokalisierten Aktivierung von FastLightR-Src, was durch eine lokale Akkumulation von LightR Src in fokaler Adhäsion und begleitet von der Bildung lokaler Membranvorsprünge (Abbildung 4B (i), (ii)) und einer Zellschwerpunktverschiebung (Abbildung 4C (i), (ii)) angezeigt wird, was zu einer Zellbewegung in Richtung Licht führt. Nachdem wir die Anwendung des LightR-Tools für die Regulation der Src-Kinase etabliert haben, zeigen wir den weitreichenden Nutzen von LightR, der sich auf die Regulation der bRaf-Kinase und der DNA-Rekombinase Cre erstreckt. Die Analyse von LightR-bRaf zeigt eine lichtinduzierte Phosphorylierung des endogenen Substrats von bRaf, MEK1, und eine nachgeschaltete Phosphorylierung von ERK1/2-Kinasen24,25 auf einem Niveau, das mit dem der konstitutiv aktiven bRaf-Mutante (V600E) vergleichbar ist (Abbildung 5A). Umgekehrt zeigt das katalytisch inaktive D575RLightR-bRaf keine MEK1- und ERK1/2-Phosphorylierung, vergleichbar mit unbeleuchteten LightR-bRaf-Proben, was die Spezifität der LightR-bRaf-Regulation bestätigt. Die Bildgebung von lebenden Zellen zeigte, dass wiederholte Zyklen der FastLightR-bRaf-Aktivierung/-Inaktivierung eine wiederholte Translokation von ERK2 in und aus dem Zellkern induzieren, was mit den bekannten Ergebnissen der bRaf-Aktivierung bestätigt28 (Abbildung 5B). Die Aktivierung von LightR-Cre führt zur erfolgreichen Rekombination eines Reporter-mCherry-Gens, was die Anwendbarkeit von LightR auf verschiedene Enzymklassen demonstriert (Abbildung 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Entwicklungsstrategie des LightR-Ansatzes. (A) Kristallstrukturen von zwei Vivid-Monomeren im dunklen Zustand (PDB: 2PD7) und des Dimers im beleuchteten Zustand (PDB: 3RH8). (B) Cartoon-Darstellung des LightR-Designs. Zwei tandemartig verbundene VVD-Photorezeptoren, die in die katalytische Domäne eingefügt sind, stören die katalytische Aktivität des Proteins im Dunkeln. Die Dimerisierung von VVD als Reaktion auf blaues Licht stellt die Proteinaktivität wieder her. (C) Kristallstrukturen von (i) Src (PDB 1Y57) und (ii) bRaf (PDB 4MNF) katalytischen Domänen. (ii) Struktur der Cre-Rekombinase (PDB 1MA7). Gelbe Pfeile zeigen die LightR-Insertionsstelle an und zeigen die substituierte Aminosäure an. (D) Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie für die Insertion der LightR-Domäne in eine Zielenzymsequenz19. In Schritt 1 werden speziell entwickelte Primer für die PCR-Synthese eines LightR-Fragments verwendet, das vor und nach der Insertionsstelle von Annealing-Stellen im Zielgen flankiert wird. In Schritt 2 wird gezeigt, dass das so erzeugte LightR-Fragment als "Megaprimer" für die Insertion von LightR in das Zielenzymgen durch Quick-change-ortsgerichtete Mutagenese verwendet wird. Die Tafeln A-C wurden mit Genehmigung von Shaaya et al.10 angepasst und modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Biochemische Charakterisierung von manipulierten LightR-Proteinen. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls zur biochemischen Charakterisierung von LightR Src. (B) LinXE-Zellen, die transient das LightR Src-Konstrukt exprimieren und ein mCherry- und ein myc-Tag am C-Terminus tragen, wurden unter Verwendung eines 465-nm-LED-Aufbaus 60 Minuten lang kontinuierlich mit blauem Licht beleuchtet. Zelllysate wurden auf Phosphorylierung von Src-Substraten, Paxillin und p130Cas untersucht. Die Ergebnisse des Western Blots zeigen die Phosphorylierung von endogenem Paxillin und p130Cas als Reaktion auf die Aktivierung von LightR-Src in lebenden Zellen. (C,D) LinXE-Zellen, die die angezeigten LightR-Src-Konstrukte transient exprimierten und am C-Terminus einen Tandem-mCherry-myc-Tag trugen, wurden kontinuierlich für bestimmte Zeiten (0 min und 30 min) blauem Licht ausgesetzt und dann für angegebene Zeiträume im Dunkeln platziert. Zelllysate wurden auf Phosphorylierung von Src-Substraten untersucht, was den Vergleich der Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik zwischen (C) LightR-Src und (D) FastLightR-Src zeigt. (E) LinXE-Zellen, die die angezeigten LightR-Src-Konstrukte transient exprimierten und am C-Terminus den Tandem-mCherry-myc-Tag trugen, wurden kontinuierlich 20 Minuten lang blauem Licht ausgesetzt, gefolgt von wiederholter Inkubation im Dunkeln für 10 Minuten und im Licht für 20 Minuten. Zelllysate wurden gesammelt und auf Phosphorylierung von Src-Substraten untersucht, was die Effizienz des Src-Kinase-Zyklus zwischen Aktivierungs- und Inaktivierungszuständen zeigt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die Zahlen, die neben den Western-Blot-Feldern B-E angezeigt werden, stellen die Molekulargewichte der Proteine dar, gemessen in Kilodalton (kDa). Die Tafeln B-E wurden mit Genehmigung von Shaaya et al.10 angepasst und modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
Abbildung 3: Globale und zeitliche Beleuchtungssteuerung und Einfluss auf die FastLightR-Src-Aktivität. (A) Karikaturdarstellung des experimentellen Schemas der globalen und zeitlichen zyklischen Beleuchtung und der anschließenden Datenanalysen. (B,C) Die Regulation der Zellmorphologie und der FastLightR-Src-Lokalisierung durch blaues Licht wird in repräsentativen Bildern von HeLa-Zellen dargestellt, die aus einer Zeitrafferserie mit Hilfe der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden. Diese Zellen exprimierten vorübergehend FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 Zellen) oder katalytisch inaktives D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 Zellen) zusammen mit Stargazin-iRFP670 (Plasmamembranmarker). Die Bildgebung von lebenden Zellen wurde im Minutentakt durchgeführt, während die Zellen global mit blauem Licht beleuchtet wurden (blaue Umrisse). (B) Gelbe Pfeile markieren die Lokalisierung von FastLightR-Src an Strukturen, die fokalen Adhäsionen ähneln. Die Bilder wurden aus einer Zeitrafferserie von HeLa-Zellen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie gewonnen. (C) Die Quantifizierung der Veränderungen in der Zellfläche, die durch die Aktivierung von FastLightR-Src vs. D388RLightR-Src induziert werden, ist auf jedem Panel dargestellt. Das Beleuchtungsfenster wird als blaue Rechtecke angezeigt. Die Diagramme stellen mittlere ± 90 %-Konfidenzintervalle dar. Die Panels B und C wurden mit Genehmigung von Shaaya et al.10 angepasst und modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Kontrolle der lokalen subzellulären Beleuchtung und Einfluss auf die FastLightR-Src-Aktivität. (A) Karikaturdarstellung des experimentellen Schemas der lokalen subzellulären Beleuchtungssteuerung. (B) (i) Zeitraffersequenz zur Darstellung einer HeLa-Zelle, die FastLightR-Src-mCherry exprimiert und lokal mit blauem Licht beleuchtet wird (dargestellt durch einen blauen Kreis). Die Bilder wurden jede Minute mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (60-fach-Objektiv) aufgenommen. Die Bilder werden als invertierte Kontrastbilder dargestellt, die in bestimmten Zeitintervallen aufgenommen wurden. (ii) Zellprojektionsbilder, die Vorsprünge zeigen, die in bestimmten Zeitintervallen gebildet wurden. Die Schwellenwertbestimmung und Maskierung der Zellmorphologie über den experimentellen Zeitrahmen stellt die Plattform zur Analyse der Zellausbreitung und der Zellranddynamik dar. Der angegebene beleuchtete Bereich der Zelle wird durch einen blauen Kreis umrandet. (C) (i) Polardiagramm für Zellen, die den Migrationsabstand (d) und den Abweichungswinkel (θ) des Schwerpunkts relativ zur lokalen Blaulichtbeleuchtung darstellen. Schwarze Punkte stellen einzelne HeLa-Zellen dar, die katalytisch inaktives D388RLightR-Src (N = 6 Zellen) oder FastLightR-Src (N = 10 Zellen) exprimieren. (ii) Schematische Darstellung der Schwerpunktverschiebungsstrecke (d), die der Schwerpunkt der Zelle von der Einleitung (1) bis zum Abschluss (2) der lokalen Blaulichtstimulation zurücklegt. Der Abweichungswinkel (θ) gibt das Ausmaß der Divergenz der Schwerpunktbewegung der Zelle von der Position des blauen Lichts an. Die hellgraue Schattierung zeigt die Region, die von der Zelle als Reaktion auf die lokale FastLightR-Src-Stimulation hervorgetreten ist. Der angegebene beleuchtete Bereich der Zelle wird durch einen durchgehenden blauen Kreis angezeigt. Die Panels B und C wurden von Shaaya et al.10 adaptiert und modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Breite Anwendbarkeit des LightR-Ansatzes. (a) Regulierung von LightR-bRaf. LinXE-Zellen, die transient LightR-bRaf-Venus, katalytisch inaktive D575R LightR-bRaf Venus oder konstitutiv aktive bRaf (V600E)-Venus exprimieren, wurden für den angegebenen Zeitraum kontinuierlichem blauem Licht ausgesetzt. Zelllysate wurden auf die Phosphorylierung der angezeigten Proteine untersucht. (B) Repräsentative Bilder, die aus einer Zeitrafferreihe von Lebendzell-Bildgebung mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden, veranschaulichen die Regulation der globalen Blaulichtantwort in LinXE-Zellen, die transient FastLightR-bRaf-Venus und mCherry-ERK2 koexprimieren. Diese Zellen wurden global mit blauem Licht beleuchtet (50 ms Impulse pro Sekunde, 50 Impulse pro Minute) für eine bestimmte Zeit, die blau umrandet ist. Die Bildgebung von mCherry-ERK2 in lebenden Zellen wurde jede Minute durchgeführt. Gelbe Pfeile markieren die Stadien der nuklearen ERK2-Lokalisierung, die durch die Blaulichtaktivierung von technisch hergestelltem bRaf induziert werden. (C) LinXE-Zellen wurden transient mit einem Floxed-stop-mCherry-Reporter und LightR-Cre-iRFP670 co-transfiziert. Die Zellen wurden bis zu 8 Stunden lang entweder dunklen Bedingungen oder pulsierendem blauem Licht (2 s an, 10 s aus) ausgesetzt. Die Bilder für alle Zeitpunkte jedes Kanals wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (10-fach-Objektiv) bei identischen Einstellungen aufgenommen und auf konsistente Helligkeits- und Kontrastwerte angepasst, um den Vergleich der Proteinexpressionsniveaus zwischen den Proben zu erleichtern. Das Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt und führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die Abbildung wurde von Shaaya et al.10 übernommen und modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: LightR-Sequenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Beschreibung der LightR-Insertionsstellen und Checkliste für das LightR-Protein-Design. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 3: Primer für das Klonen von LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 4: Transfektionsbedingungen für die biochemische Analyse der LightR-Protein-Aktivität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 5: Transfektionsbedingungen für die bildgebende Analyse der LightR-Protein-Aktivität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Gepulste Beleuchtung mit integrierter Entwicklungsumgebung (IDE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Einstellungen für die Mikroskopbeleuchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

spatiotemporal-control-protein-activity-through-optogenetic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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