Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation

Unsere gesamte Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung optogenetischer Methoden, die eine präzise raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch Licht ermöglichen. Wir entwickeln lichtregulierbare Domänen namens lightR für die allosterische Regulation, die es uns ermöglichen zu untersuchen, wie sich die raumzeitlich kontrollierte Proteinaktivität auf die zelluläre Signalübertragung und -funktion auswirkt, was bei der präklinischen Krankheitsmodellierung und Therapieentwicklung hilft. Die Optogenetik steht vor mehreren Herausforderungen, darunter die präzise und reversible Kontrolle der Zielproteinaktivität und die genaue Nachahmung der endogenen Signalkinetik.

Zu den wichtigsten Themen gehören die Verhinderung unerwünschter Aktivierungen, die Ermöglichung einer gezielten subzellulären Aktivierung und das Management der Phototoxizität, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Darüber hinaus ist die Entwicklung universell kompatibler und robuster Werkzeuge entscheidend für die Verbesserung der Vielseitigkeit und Reproduzierbarkeit in Anwendungen. Unser Protokoll für die Entwicklung von lightR-Tools kombiniert auf einzigartige Weise mehrere fortschrittliche Funktionen in einem einzigen System, darunter allosterische Regulierung, hohe Empfindlichkeit, räumliche Auflösung, strenge zeitliche Kontrolle und präzise Signalspezifität.

Diese Integration ermöglicht eine Abstimmbarkeit über verschiedene Zielproteine hinweg und schließt die Lücken in anderen Methoden, denen eine oder mehrere dieser kritischen Fähigkeiten fehlen könnten. Wir sind daran interessiert, wichtige Signal- und Strukturprozesse zu definieren, die die Zellmigration regulieren. Unser Ziel ist es, unsere optogenetische Technologie zu nutzen, um die Regulation der Migration und Interaktion von Endothelzellen zu entschlüsseln.

Verstehen Sie, wie der Umbau der extrazellulären Matrix durch Endothelzellen vermittelt wird, und bestimmen Sie, wie eine Dysregulation dieser Prozesse zur Krankheitsentwicklung beiträgt. Für die biochemische Analyse der lightR-Kinasenplatte eins mal 10 hoch sechs lin XE-Zellen für eine 3,5 Zentimeter große Zellkulturschale für jede Versuchsgruppe inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 16 bis 18 Stunden. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit dem ausgewählten DNA-Konstrukt unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsreagenzes.

Decken Sie die Schale mit Alufolie ab und stellen Sie sie wieder in den Inkubator. Nach 16 bis 18 Stunden Transfektion platzieren Sie ein 465-Nanometer-LED-Panel-Lampensystem in den Gewebekultur-Inkubator. Positionieren Sie eine perforierte Plexiglasscheibe 10 Zentimeter über der Lampe, um eine Ausleuchtung von drei Milliwatt pro Quadratzentimeter zu erreichen.

Verwenden Sie eine kontinuierliche Beleuchtung in Zellen, die LightR-Src und D388 R-LightR-Src exprimieren. Schalten Sie das LED-Panel manuell ein und aus, um die Beleuchtung zu steuern. Am Ende der experimentellen Zeitpunkte ernten Sie die Zellen unter sicherem rotem Licht, saugen das Medium an und waschen die Zellen mit kaltem PBS.

Die globale Beleuchtung von lin-XE-Zellen mit manipuliertem LightR-Src für 60 Minuten zeigt eine Phosphorylierung von Src-Substraten, endogenen Paxillin- und p130Cas-Zellen, die die katalytisch inaktive D388 RLightR-Src-Mutante exprimieren, zeigen keine Phosphorylierung von Src-Substraten bei globaler Beleuchtung. Zu Beginn wird zweimal mal 10 hoch fünf Hela-Zellen pro 35-Millimeter-Gewebekulturschale in Zellkulturmedien plädiert. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Sobald sich die Zellen anheften und eine Konfluenz von 60 bis 70 % erreicht haben, cotransfizieren Sie die Hella-Zellen mit der gegebenen Mischung. Decken Sie die Schale mit Alufolie ab, um ein versehentliches Aufleuchten der Zellen zu verhindern. Dann inkubieren Sie die Zellen 16 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Platzieren Sie anschließend abgedeckte Gläser mit einem Durchmesser von 25 Millimetern und einer Dicke von 0,17 Millimetern in eine Sechs-Well-Plattenkammer. Beschichten Sie drei runde Glasdeckgläser mit fünf Milligramm Fibronektin pro Liter in PBS und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie dann die Deckgläser 16 bis 18 Stunden nach der Transfektion mit PBS aus.

Sammeln Sie die transfizierten Helazellen in sicherem, rotem Licht und spielen Sie sie dann ungefähr einmal 10 hoch mit der Potenz von fünf transfizierten Helazellen auf jeden Deckzettel unter sicherem, rotem Licht. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang in Zellkulturmedien bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Erwärmen Sie anschließend das vorbereitete Bildmedium und das Mineralöl auf 37 Grad Celsius.

Waschen Sie dann die Deckgläser mit den Zellen zweimal mit PBS. Legen Sie nach dem Färben und Waschen der Zellen den Deckglas vorsichtig in eine Bildgebungskammer für lebende Zellen. Geben Sie einen Milliliter L15-Bildgebungsmedium in die Kammer.

Geben Sie einen Milliliter vorgewärmtes Mineralöl in das Medium, um eine Verdunstung während der Bildgebung zu verhindern. Bewahren Sie die Kammer vor Licht bei 37 Grad Celsius auf, bis sie für das Bild bereit ist. Stellen Sie die Kammer auf einen auf 37 Grad Celsius vorgeheizten Mikroskoptisch.

Wählen Sie eine einzelne Zelle aus, die sowohl das schnelle LightR-Src Cherry als auch Src ein IRFP ausdrückt. Wählen Sie bestimmte interessante Bereiche innerhalb der Zelle aus, die beleuchtet werden sollen. Wählen Sie für diese Studie einen kleinen Bereich an der Peripherie der ausgewählten Zelle.

Bilden Sie die ausgewählte Zelle 20 Minuten lang jede Minute im basalen Zustand ab, bevor Sie sie beleuchten. Setzen Sie die Bildgebung 50 Minuten lang fort, während Sie lokal leuchten, gefolgt von 20 Minuten nach der Aktivierung für insgesamt 90 Minuten. Speichern Sie die Filme nach dem Imaging zur Analyse im TIF-Stack-Dateiformat.

Die globale Beleuchtung von Hela-Zellen führte zur Lokalisierung von schnellem LightR-Src an fokalen Adhäsionen, die sich nach dem Ausschalten des blauen Lichts umkehrten. Diese Beleuchtung führte auch zu einem signifikanten Anstieg der Zellausbreitung, die aufhörte, sobald das blaue Licht ausgeschaltet wurde. Die katalytisch inaktive D388 R-LightR-Src-Mutante zeigte keine Zellausbreitung.

Die lokalisierte Beleuchtung von Helazellen, die schnelles LightR-Src exprimieren, führte zu einer Akkumulation des Konstrukts in fokalen Adhäsionen, was zu lokalisierten Membranvorsprüngen bei 50-minütiger Beleuchtung führte. In 20 Minuten Dunkelheit nach der Beleuchtung wurde kein weiterer Flächengewinn beobachtet. Fast LightR-Src verschwand in der Dunkelphase allmählich aus den fokalen Adhäsionen.

Der Zellschwerpunkt verschob sich in Richtung des beleuchteten Bereichs. Nach schneller LightR-Src-Aktivierung, die auf eine gerichtete Zellbewegung hinweist.