Name: Einzelmolekül-FRET-Bildgebung zur Beobachtung der Konformationsdynamik von Dynamin-ähnlicher GTPase Atlastin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Erfahren Sie, wie Einzelmolekül-FRET die Konformationsdynamik von Atlastin während des GTP-Hydrolysezyklus aufklärt. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Membranfusionsmechanismen.

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<meta charset="utf8"></head><body>Überwachung der GTPase Atlastin in verschiedenen Nukleotid-Beladungszuständen

<ol><li>Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins.</a> Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).</li>
<li>Kalia, R., Frost, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+and+cut%3A+Allosteric+motion+and+membrane+fission+by+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins.</a> Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).</li>
<li>Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamin superfamily.</a> Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).</li>
<li>Bryce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastin-3+is+a+constitutive+ER+membrane+fusion+catalyst%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst.</a> J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).</li>
<li>Crosby, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+human+atlastin+fusion+activity+reveals+autoinhibition+by+the+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus.</a> J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+dynamin-like+GTPases+involved+in+the+generation+of+the+tubular+er+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network.</a> Cell. 138 (3), 549-561 (2009).</li>
<li>Jang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastins+are+sufficient+to+drive+the+fusion+of+liposomes+with+a+physiological+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition.</a> J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin-1+regulates+morphology+and+function+of+endoplasmic+reticulum+in+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites.</a> Nat Commun. 10 (1), 568(2019).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+gtpase+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin.</a> Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).</li>
<li>Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin+GTPases+are+required+for+Golgi+apparatus+and+er+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis.</a> Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).</li>
<li>Faust, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+C-terminal+tail+is+an+amphipathic+helix+that+perturbs+the+bilayer+structure+during+endoplasmic+reticulum+homotypic+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion.</a> J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).</li>
<li>Liu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+interaction+of+the+c+terminus+and+association+of+the+transmembrane+segments+facilitate+atlastin-mediated+homotypic+endoplasmic+reticulum+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).</li>
<li>Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+the+GTPase+atlastin+requires+a+conserved+c-terminal+cytoplasmic+tail+and+dimerization+through+the+middle+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+atlastin+GTpase+provide+insight+into+homotypic+fusion+of+endoplasmic+reticulum+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).</li>
<li>Byrnes, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+conformational+switching+and+GTP+loading+of+the+large+g+protein+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin.</a> EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).</li>
<li>Byrnes, L. J., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+nucleotide-dependent+dimerization+of+the+large+g+protein+atlastin-1%2Fspg3a%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).</li>
<li>Morin-Leisk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intramolecular+salt+bridge+drives+the+soluble+domain+of+gtp-bound+atlastin+into+the+postfusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation.</a> J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).</li>
<li>Pendin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+packing+of+a+three-helix+bundle+is+required+for+atlastin-mediated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).</li>
<li>Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crossover+conformational+shift+of+the+GTPase+atlastin+provides+the+energy+driving+ER+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion.</a> J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+yeast+dynamin-like+GTPase+sey1p+provide+insight+into+homotypic+er+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion.</a> J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).</li>
<li>Rizo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release.</a> Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).</li>
<li>Gao, S., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion%3A+The+machineries+in+and+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion: The machineries in and out.</a> Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).</li>
<li>Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypervariable+region+of+atlastin-1+is+a+site+for+intrinsic+and+extrinsic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation.</a> J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).</li>
<li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR-mediated+beta-arrestin+activation+deconvoluted+with+single-molecule+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision.</a> Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+translocation+underlying+chromatin+remodelling+by+snf2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2.</a> Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+dynamin-like+MXA+revealed+by+single-molecule+fret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret.</a> Nat Commun. 8, 15744(2017).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+mechanism+of+atlastin-mediated+homotypic+membrane+fusion+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level.</a> Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).</li>
<li>Guelly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high-throughput+sequencing+identifies+mutations+in+atlastin-1+as+a+cause+of+hereditary+sensory+neuropathy+type+i%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i.</a> Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).</li>
<li>Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+CRISPR%2FCas9+induced+atlastin+pathological+mutations+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila.</a> Front Neurosci. 14, 547746(2020).</li>
<li>Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+network+formation+and+membrane+fusion+by+atlastin1%2Fspg3a+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+newly+identified+GTPase+gene+cause+autosomal+dominant+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia.</a> Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10 K Zentrifugalfilter</td><td>Amicon</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>45 Ti Rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>532 nm Laser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>640 nm</td><td>Laser Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 K MWCO Spin-Entsalzungssäulen</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-5-triphosphat-Dinatriumsalz (ATP)</td><td>Roche</td><td>11140965001</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242381</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td>170-124</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierter Anti-His-Antikörper</td><td>Bioss Antikörper</td><td>bs-0287R-bio</td><td></td></tr><tr><td>d-biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>IX897</td><td></td></tr><tr><td>Guanosin-5-Diphosphat-Natriumsalz (GDP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; G7127</td><td></td></tr><tr><td>Guanosin 5'-O-[gamma-thio]triphosphat (GTP&gamma; S)</td><td>Roche</td><td>10220647001</td><td></td></tr><tr><td>Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon, 100x, N.A. 1.49, Ölimmersion</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr> <tr><td>Isopropyl-&Beta;-D-Thiogalactosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LD555-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure Kalium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Natick, MA</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Fisherbrand</td><td>18834</td><td>&nbsp;( 24 mm & mal; 60 mm)</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td></td><td></td><td>Kundenspezifisch, (75 mm & mal 26 mm - mal 1 mm) mit 6 Paaren mit 1,2 mm Durchmesser Durchgangslöcher</td></tr><tr><td>mPEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td>170-106</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17531802</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>Origin Software</td><td></td><td>https://www.originlab.com/</td></tr> <tr><td>Polystyrolpartikel</td><td>QDSphere</td><td>AG1265</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuat 3,4-Dioxygenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610492</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Erhöhung (10/300 GL)</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>TIRF Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP)</td><td>Thermo</td><td>75259</td><td></td></tr></tbody></table>

einzelmolekül-fret-bildgebung zur beobachtung der konformationsdynamik von dynamin-ähnlicher gtpase atlastin

Single-Molecule FRET Imaging for Observing the Conformational Dynamics of Dynamin-Like GTPase Atlastin

Die smFRET-Experimente wurden an einem TIRF-Mikroskop durchgeführt, indem die Fluoreszenzintensität von Fluorophoren alle 30 ms erfasst wurde. Repräsentative Bilder von LD555 (Donor) und/oder LD655 (Akzeptor)-markierten ATL1-Cytomolekülen in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Nukleotide sind in Abbildung 2A-C dargestellt. Die Fluoreszenzintensitäten der beiden Fluorophore an einzelnen Partikeln wurden aufgezeichnet und Hunderte von FRET-Tr...

Einzelmolekül-FRET-Bildgebung zur Beobachtung der Konformationsdynamik von Dynamin-ähnlicher GTPase Atlastin

The rigid-body rotation of the three-helical middle domain (3HB) relative to the GTPase domain of dynamin-like protein atlastin (ATL) is a crucial driver ...

single-molecule-fret-imaging-for-observing-conformational-dynamics

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Wir beschreiben, wie Mikro- und Fotomanipulation Techniken wie FRAP und photoaktivierungen ermöglichen die Bestimmung der Motilität Parameter und die räumlich-zeitliche Dynamik der Proteine innerhalb Migration Zellen. Experimentellen Messwerte sind subzelluläre Dynamik und Umsatz der Motilität Regulierungsbehörden oder des zugrunde liegenden Aktin-Zytoskeletts.

Mikromanipulation Techniken Analyse der morphogenetischen Dynamik und Umsatz des Zytoskeletts Regulatoren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Wir berichten über einen hybriden Ensemble- und Einzelmolekül-Assay zur direkten Abbildung und Quantifizierung der Bewegung von fluoreszenzmarkierten, vollständig rekonstituierten Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) Helikase auf linearen DNA-Molekülen, die in einer optischen Falle an Ort und Stelle gehalten werden.

Hybrid-Ensemble und Einzelmolekül-Assay zur Abbildung der Bewegung von vollständig rekonstituiertem CMG

Hier stellen wir Methoden zur Herstellung quasi-zweidimensionaler (2D) verschränker, vernetzter und flüssigkristalliner Aktin-Anordnungen aus gereinigten Proteinen vor.

Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

Erfahren Sie, wie Einzelmolekül-FRET die Konformationsdynamik von Atlastin während des GTP-Hydrolysezyklus aufklärt. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Membranfusionsmechanismen.

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