Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

Die Rolle bestimmter Gene bei der Entstehung und Entwicklung von Thrombosen, in diesem Fall untersuchen wir die endotheliale PAR1-Expression bei Ischämie-Reperfusionsschäden. Wir versuchen, die Wirkung des Endothels auf die Reaktion sowohl nach Ischämie als auch während der Reperfusion zu bestimmen. Ein wirklich wichtiger Aspekt, der bisher wenig untersucht wurde, ist die Bestimmung der Rolle der Darmkommensalen bei mesenterialen Ischämie-Reperfusionsschäden.

Um diese Frage zu untersuchen, kombinierte unsere Gruppe die intravitale Mikroskopie mit einem mesenterialen Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodell, und wir kombinierten dieses mit keimfreien Mausmodellen. Die Anwendung von Thrombosemodellen auf transgene Mäuse in Kombination mit der Intravitalmikroskopie ermöglicht die in vivo Beobachtung des zellulären Verhaltens während des Ausbruchs der Krankheit. Die Durchführung von Versuchsmodellen an lebenden Organismen ist immer eine Herausforderung, da das Experiment von vielen Faktoren beeinflusst wird, darunter Geschlecht, Alter, Anästhesiebehandlung, Änderungen der Tierschutzbestimmungen usw.

Auch die Forschung im Bereich der Thrombose begann im letzten Jahrhundert. Viele Faktoren, die dazu beitragen, sind noch ungeklärt. Meine Gruppe untersucht die Rolle der Darmmikrobiota bei Thrombose, Atherosklerose, Blutplättchenfunktion und Vaskularisation.

Positionieren Sie die betäubte, rasierte Maus zunächst in einer dorsalen Auflage auf einem Heizkissen. Verbinden Sie die Maus über einen Nasenkonus mit dem Sauerstoffsystem. Befestigen Sie die Gliedmaßen der Maus mit chirurgischem Klebeband auf dem Heizkissen.

Für die Implantation des Katheters in die Halsvene wird ein Querschnitt über der Luftröhre vorgenommen. Entfernen Sie die Haut, die den Hals bedeckt, und isolieren Sie die rechte Halsvene. Verschließen Sie dann mit einem fünf Zentimeter langen Seidenfaden das distale Ende der Vene und fixieren Sie es mit einer chirurgischen Zange.

Lege drei Seidenfäden etwa zwei Zentimeter unterhalb der Vene, einen in der Nähe des distalen Endes und zwei in der Nähe des proximalen Endes der Vena jugularis. Binden Sie einen chirurgischen Knoten, aber schließen Sie das Gefäß nicht. Füllen Sie einen Polyethylen-Katheter mit 0,9 % Natriumchlorid.

Entfernen Sie die Luftblasen und stecken Sie sie in eine Ein-Milliliter-Spritze. Schneiden Sie mit einer Schere ein Loch zwischen dem zweiten und dritten Knoten und implantieren Sie den Katheter in die Halsvene. Aspirieren Sie die Spritze, um sicherzustellen, dass Blut im Katheter vorhanden ist.

Binden Sie den Seidenfaden zusammen, um den Katheter in der Vene zu befestigen. Verwenden Sie dann ein medizinisches Klebeband, um die Spritze zu sichern. Füllen Sie eine Milliliterspritze mit Acridinorange in einer Endkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter und Nukleinsäurefarbstoff mit einer Konzentration von fünf Mikromolaren.

Injizieren Sie 50 Mikroliter SYTOX Orange für neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs. Desinfizieren Sie die Bauchhaut der Maus mit abwechselnden Peelings auf Jodbasis und Alkohol. Führen Sie dann mit einem Skalpell eine drei bis fünf Zentimeter lange Laparotomie entlang der linearen Alba durch.

Positionieren Sie den Darm vorsichtig mit zwei mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen aus der Bauchhöhle und identifizieren Sie eine Stelle mit minimaler Fettbedeckung. Positionieren Sie kleine Äste des Darms auf einem schwarzen Teig, um das Hintergrundsignal zu reduzieren. Injizieren Sie 50 Mikroliter Acridinorange durch den Chorularvenenkatheter, um die gefärbten Leukozyten sichtbar zu machen.

Nehmen Sie das Video des Darms vor der Ischämie-Reperfusion auf. Bereiten Sie eine mit Natriumchlorid angefeuchtete Kompresse vor und legen Sie den Darm hinein. Die Arteria mesenterica superior mit einer kleinen Gefäßklemme verschließen.

Schieben Sie den Darm mit mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig zurück in die Bauchhöhle. Verwenden Sie eine 7-0-Naht, um die Bauchdecke zu schließen und Feuchtigkeits- und Temperaturverlust zu verhindern. Entfernen Sie nach einer Stunde die Naht.

Tragen Sie nach der ischämischen Phase einige Tropfen Kochsalzlösung auf die abgeschnittene Stelle auf. Entfernen Sie dann vorsichtig die mikrovaskulären Clips mit einem Clip-Applier. Mit mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen den Darm vorsichtig wieder aus der Bauchhöhle heraus positionieren und die kleinen Venenäste auf einen schwarzen Teig legen.

Injizieren Sie 50 Mikroliter Acridinorange und nehmen Sie das postischämische Video der Vene auf. Schalten Sie das Hochgeschwindigkeits-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop ein, das mit einem Langstreckenkondensor, einem Monochromator, einem 10-fachen Wasserimmersionsobjektiv und einer ladungsgekoppelten Gerätekamera ausgestattet ist. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden ein und wählen Sie den 5B-Kanal mit installierten Alexa Fluor 488 und Rhodaminrot-Filtern, um die Leukozyten und NETs sichtbar zu machen.

Quantifizieren Sie die Zellrekrutierung innerhalb eines interessierenden Bereichs von 0,06 Quadratmillimetern. Quantifizieren Sie dann adhärente Leukozyten, indem Sie Zellen zählen, die während eines 20-sekündigen Beobachtungszeitraums stationär oder an der Endothelschleimhaut befestigt blieben. Identifizieren Sie NETs, die sowohl mit Leukozyten- als auch mit Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.

Die Leukozytenadhäsion an das ischämische mesenteriale Endothel nahm sowohl in der Wildtyp- als auch in der F2r-delta-EC-Gruppe nach einer Ischämie-Reperfusionsverletzung zu, wobei in der F2r-delta-EC-Gruppe eine deutlich geringere Adhäsion beobachtet wurde, was auf eine Rolle des endothelialen PAR1 bei der Leukozytenrekrutierung hindeutet. Nach Ischämie-Reperfusionsschäden wurden NETs nur in der Wildtyp-Gruppe beobachtet, die normale PAR1-Spiegel auf den Endothelzellen exprimierten, was auf eine regulatorische Rolle von PAR1 bei der NETose hinweist.