Name: Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung zellulärer Dynamiken.

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<meta charset="utf8"></head><body>Die Rolle des endothelialen PAR1 bei der Leukozytenadhäsion und NET-Bildung während einer I/R-Verletzung

<table><tbody><tr><td>Acridin-Orange</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; A-6014</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte Multiplikation PCR-Platten&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiesysteme für Nagetiere</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>schwarzer Teig</td><td>Staedtler</td><td></td><td>Modelliermasse</td></tr><tr><td>CD146 Mikrokügelchen, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td>Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>Software</td></tr><tr><td>Kamera für ladungsgekoppelte Geräte</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>B&ouml; ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>Gebogener Hämostat 125mm/5"</td> <td>Indigo Instruments&nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Balea</td><td>nicht anwendbar</td><td></td></tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol p.a. 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>Extra schmale Schere &ndash; Straight/Sharp-Sharp/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette "Dumont #5" (Inox, Spitze 0.1mm, Länge 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td></td><td>Graphpad Prism 10</td><td>Software</td></tr><tr><td>Isofluran&nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Leukofix Medical Tape</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>Leberdissoziationskit, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>LS-Trennsäulen MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer 100 &Mikro; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B Seal Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Nicht resorbierbares geflochtenes Seidennaht, Größe: 7/0, 91 Meter&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51WI Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop PCR für Röhrchenstreifen</td><td>Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>PCR Röhrchendeckel</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>Plyethylen Katheter</td><td>Smith Medical Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Prolene (8648G), Polypropylen 6-0, Nahtmaterial&nbsp;</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH&nbsp;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Tanscription Kit (cDNA mit hoher Kapazität)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>Schulwaage&nbsp;</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>Federschere - seitlich abgewinkelt</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Hämostaten 135mm/5.5"</td> <td>Indigo Instruments&nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 1 mL</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler TC-1000</td><td>FMI F&oml; hr Medical Instruments GmbH</td><td>nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange - 1x2 Zähne</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Gefäßklemme</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von neutrophilen extrazellulären traps in mesenterialen venolen nach mesenterialer ischämie-reperfusionsverletzung mittels intravitaler mikroskopie

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Um die endothelzellabhängigen Effekte auf das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten sowie auf die NET-Bildung zu untersuchen, wurde zunächst die Wirksamkeit des VE-Cadherin Cre induzierbaren F2r-Mangels in Endothelzellen untersucht. Die magnetische Zellsortierung wurde eingesetzt, um hepatische Endothelzellen zu isolieren. Anschließend wurde RNA isoliert, gefolgt von einer quantitativen real-time PCR (qRT-PCR). Die F2rΔEC-Mäuse , in denen die Cre-Rekombinase, die unter der Kontrolle des VE-Cadherin-Promotors exprimiert wird, nicht vorhanden ist, zeigten im Vergleich zu WT-Kontrollen signifikant reduzierte F2r (PAR1) mRNA-Spiegel (ca. um ein Drittel) (Abbildung 1).
Nach Bestätigung des Mangels in der Mauslinie wurde eine mesenteriale I/R-Schädigung durchgeführt, um den Einfluss von PAR1, das von vaskulären Endothelzellen exprimiert wird, auf das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten zu untersuchen, sichtbar durch Intravitalmikroskopie (Abbildung 2A, B). Nach 1 h Ischämie wurde die Klemme entfernt und das Gefäß konnte reperfundiert werden. Das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten wurden beobachtet und aufgezeichnet (grün gefärbt, durch weiße Pfeile gekennzeichnet). Obwohl beide Gruppen eine erhöhte Anzahl adhärenter Leukozyten nach I/R-Verletzungen aufwiesen, führte der Mangel an endothelialem F2r (PAR1) zu einer deutlichen, aber nicht signifikant verringerten Leukozytenadhäsion an das I/R-aktivierte mesenteriale Endothel, was auf eine aktive Rolle der endothelialen PAR1-Aktivierung bei der Rekrutierung von Leukozyten an die ischämischen mesenterialen Venolen hindeutet (Abbildung 2C).
Das nächste Ziel war es, zu untersuchen, ob die endotheliale PAR1-Expression die durch I/R-Verletzungen induzierte NET-Bildung reguliert. Daher wurden extrazelluläre Nukleinsäuren mit einem zellundurchlässigen Farbstoff30 gefärbt und die erzeugten NETs mittels Intravitalmikroskopie sichtbar gemacht (gekennzeichnet durch schwarze Pfeile) (Abbildung 2A,B). Nach I/R-Verletzungen wurden NETs nur in der WT-Gruppe beobachtet, die normale PAR1-Spiegel auf den Endothelzellen exprimierten, was auf eine regulatorische Rolle von PAR1 bei der NETose hinweist (Abbildung 2C,D). Bemerkenswert ist, dass bei unterdrückter endothelialer F2r-Expression keine NETs in den I/R-verletzten mesenterialen Venolen vorhanden waren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg"> 
Abbildung 1: F2r (PAR1) mRNA-Expression. F2r-Leber-Endothelzellexpression von WT (n = 6) und F2rΔEC (n = 9) Mäusen im Verhältnis zum L32-Housekeeping-Gen . Die Daten werden als Median mit einem Konfidenzintervall von 95 % dargestellt. Der Mann-Whitney-Test wurde verwendet, um zwei unabhängige Gruppen zu vergleichen, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Endotheliales PAR1 beeinflusst die Leukozytenadhäsion und die NET-Bildung in I/R-geschädigten Mesenterialvenolen. Repräsentative intravitale Mikroskopiebilder von adhärenten Leukozyten, die mit Acridin-Orange (weiße Pfeile) gefärbt wurden, und NETs, die mit Sytox-Orange gefärbt wurden (schwarze Pfeile) von WT- und F2r-ΔEC-Mäusen vor (vor) und nach (post) I/R-Verletzungen, (A) 10-fache und (B) 20-fache Vergrößerung. Maßstabsleisten: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Leukozytenadhäsion und (D) NETs promm 2 von WT (n = 7) und F2rΔEC (n = 4) Mäusen vor (vor) und nach (post) I/R-Verletzung. Alle Daten wurden als Median mit einem Konfidenzintervall von 95 % dargestellt. Statistische Vergleiche wurden unter Verwendung des Zwei-Wege-ANOVA-Tests **p&lt; 0,01 und der Mehrfachvergleichstests von Sídák durchgeführt, um die Mittelwerte verschiedener Genotypen zu jedem Zeitpunkt (vor und nach Ischämie) zu vergleichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

visualization-neutrophil-extracellular-traps-mesenteric-venules-after

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer Ischämie-Reperfusion (IR) Modell auf Mausohrhaut mit Magnetspann. Mit Hilfe eines speziell angefertigten intravital Bildgebung Modell untersuchen wir in vivo Entzündungsreaktionen post-Reperfusion. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung dieser Technik besteht darin, das Verständnis zu verlängern, wie Leukozyten Haut IR Verletzung reagieren.

Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind dreidimensionale Strukturen, die durch stimulierte neutrophile Granulozyten erzeugt werden. In den letzten Jahren hat sich herabimsiert, dass NETs an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind. Der Nachweis von NETs im Gewebe kann diagnostische Relevanz haben, daher sind standardisierte Protokolle für die Kennzeichnung von NET-Komponenten erforderlich.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten kardiogenen arterieogenen arteriellen Thromben mit wärmeinduziertem Antigen-Retrieval und einem doppelten Immunlabeling-Protokoll.

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Lernen Sie die Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung zellulärer Dynamiken.

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

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