Name: Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien dient. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zur bakteriellen Physiologie und Pathogenese.

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Diese Studie wurde finanziert durch den National Science Foundation (NSF) CAREER Award 1844854, den American Lung Association Innovation Award IA -937538 und das National Institute of Health (NIH) NIAID R21 AI109293 to S.P. Aktuelle Adresse für Allexa D. Burger ist das Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa, Honolulu, Hawaii, USA.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Ein wesentlicher Beitrag zur Wissenslücke über die mechanistische Untermauerung von Alt-Ribosomen ist die Schwierigkeit, Zn2+-limitierende Bedingungen in vitro zu erreichen. Spuren von Zn2+ -Kontaminationen im Labor sind häufig; Daher ist es eine Herausforderung, reproduzierbare Zn2+-begrenzte Wachstumsbedingungen zu erreichen. Zn2+ -Kontaminationen können aus verschiedenen Quellen stammen, obwohl die bedeutendste und häufigste Quelle für Kontamination und Variabilität das Reinstwasser ist, das zum Spülen von Laborgeräten und zur Herstellung von Medien verwendet wird. Reinstwassersysteme sollten ordnungsgemäß gewartet und 1 Minute lang gespült werden, bevor Laborgeräte gespült oder Wasser für Medien verwendet werden. Kolben, die nicht gut gewaschen oder mit Reinstwasser gespült werden, können eine Zn2+- Kontamination verursachen, was sich in der erhöhten Zelldichte in bestimmten Kolben zeigt, in anderen jedoch nicht in anderen aus derselben ZLM-Charge. Mit fabrikneuen Kolben kann beurteilt werden, ob die Quelle der Zn2+- Kontamination aus wiederverwendeten Kolben oder Medien stammt. Die Kontamination von Zn2+ in ZLM sollte durch verstärktes Spülen von Gegenständen, die zur Herstellung von Medien verwendet werden, und einer bestimmten Reihe von Materialien für die ZLM-Zubereitung behoben werden. Wenn keine dieser Maßnahmen die erwarteten Bioindikator-Phänotypen erreicht, sollte der [Zn2+] in Reinstwasser und ZLM quantifiziert werden, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Wasserquelle mit Zn2+ kontaminiert ist. Wie bereits berichtet, beträgt der [Zn2+] von ZLM 115 ± 37 nM23, und Konzentrationen unter 70 nM und über 150 nM führten in der Regel zu Zn2+-abgereicherten bzw.Zn 2+-kontaminierten Phänotypen. Eine gute Medienvorbereitung ist jedoch nur ein Faktor, der das Ergebnis beeinflusst, und unzureichendes oder übermäßiges Zn2+ kann aufgrund der unsachgemäßen Vorbereitung des Inokulums und/oder der Kultivierung, d. h. eines schlechten Umfüllens von Zn2+-reichen Medien während der Waschschritte, auftreten. Alle hier enthaltenen M. smegmatis-Kulturen wurden auf die gleiche Weise hergestellt - die Wachstumsergebnisse von Zn2+-kontaminierten (ZLM-C) und Zn2+-abgereicherten (ZLM-D) sind enthalten, um die Variabilität hervorzuheben, die zwischen verschiedenen Medienchargen mit demselben Reinstwassersystem auftreten kann, selbst wenn die Experimente korrekt durchgeführt werden.
Um sicherzustellen, dass die Kultivierung von Zellen in ZLM reproduzierbare Zn2+-limitierende Bioindikator-Phänotypen ergibt, ist es wichtig, die Kolben eindeutig zu kennzeichnen, sie immer für die gleiche Bedingung zu verwenden (d. h. mit ZLM oder ZRM), Kolben über mehrere Verwendungszwecke zu verfolgen und Kolben zu entsorgen, die sich am Ende ihres Lebenszyklus befinden oder weiterhin Zn2+-kontaminierte Bioindikator-Phänotypen mit ZLM ergeben. Die richtige Inokulumvorbereitung ist sehr wichtig, um ein Zn2+-limitierendes Wachstum zu erreichen, da Zn2+ -Verschleppung aus unzureichend gewaschenen Samenzellen eine häufige Quelle für Zn2+-Kontamination ist, die von Zn2+-kontaminiertem ZLM schwer zu analysieren sein kann. M. smegmatis-Kulturen sollten nach 72 Stunden Wachstum in ZLM (und parallel angebautem ZRM) untersucht und geerntet werden. Die Phänotypen der Morphogenese und der Bioindikatoren sind zwischen 48 und 72 h ausgeprägt; Daher kann die Bewertung oder Ernte von Kulturen auf Zn2+ -Limitierung zu früh (oder zu spät) nicht den vollständigen Bioindikator-Phänotyp liefern. Kulturen, die an Zn2+ abgereichert sind, weisen Zelllängen auf, die denen ähneln, die mit Zn2+ kontaminiert sind. daher sollten F420 Fluoreszenz und OD600 verwendet werden, um die beiden zu unterscheiden. Ebenso wachsen Zn2+-kontaminierte Kulturen möglicherweise nicht immer besser alsZn 2+-begrenzte Bakterien, aber die F420-Fluoreszenz und die Zelllänge des Wildtyps und der ΔaltRP-Mutante sollten zeigen, ob dieZn 2+-begrenzte Bedingung erreicht ist.
Das Gleiche gilt für M. tuberculosis, da der Verlust des Phänotyps des F420-Bioindikators in Zn2+-begrenzten Kulturen zwischen 8 und 10 Tagen des Wachstums in ZLM ausgeprägt ist. Obwohl M. tuberculosis keinen starken Zn2+-begrenzten Bioindikator-Phänotyp wie M. smegmatis aufweist, wurde die hier vorgestellte Wachstumsmethode verwendet, um den Verlust des F 420-Bioindikator-Phänotyps mit Zn2+-begrenztem Wachstum zu assoziieren, wobei funktionelle Assays und Transkriptomik sowohl bei den virulenten als auch bei den abgeschwächten Stämmen von M. tuberculosis verwendet wurden (ref23und unveröffentlichte Daten). Daher ist die anschließende F420-Fluoreszenz ein zugänglicher Weg, um biologischeZn 2+-limitierende Bedingungen bei M. tuberculosis zu überwachen und zu verifizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass der Mechanismus, der zu einer verminderten F420-Fluoreszenz unter Zn2+-limitierenden Bedingungen führt, ungeklärt bleibt, ebenso wie die Unterscheidung, ob die verminderte Fluoreszenz auf eine verminderte Abundanz des Coenzympools als Ganzes oder auf eine Verschiebung seines Redoxzustands zurückzuführen ist, da nur die oxidierte Form Fluoreszenz29 emittiert.
Wie hier gezeigt, ist die Herstellung vonZn 2+-begrenzenden Medien nuanciert, und es gibt zahlreiche Faktoren, die die effektive Konzentration von Zn2+- Ionen in den Medien beeinflussen können, selbst wenn das gleiche Protokoll und die gleichen Reagenzien verwendet werden. Spuren von Zn2+ in ZLM ermöglichen ein ausreichendes Wachstum und eine ausreichende Expression des Zn2+-limitierenden Phänotyps. Diese allmähliche Abnahme von Zn2+ zur Erreichung einer Begrenzung ähnelt dem Wayne-Modell der Hypoxie, bei dem Sauerstoff allmählich von Bakterien verbraucht wird, die in einem geschlossenen Kolben gezüchtet werden30. Da sowohl Hypoxie als auch Zn2+-begrenzte Phänotypen vom Bakterienwachstum abhängen, hören die Bakterien auf, zu wachsen, bevor sie in der Lage sind, das entsprechende morphogene Programm zu durchlaufen, wenn nicht genügend Sauerstoff oder in diesem Modell Zn2+ im Inokulum oder Medium vorhanden ist. Während die Zn2+ -Kontamination ein offensichtlicheres Problem darstellt, wenn man eine Zn2+ -Begrenzung erreichen möchte, könnte der Zn2+ -Abbau aufgrund der Wachstumsbeeinträchtigung und des übersehenen Zn2+-abhängigen Auslösers während des aktiven Wachstums auch ein Problem darstellen. Darüber hinaus wirkt sich die Verwendung von Monochromator- oder Filter-basierten Plattenlesegeräten mit Top- oder Bottom-Reading-Modus für die Fluoreszenzintensität leicht auf den berechneten F375/420-Prozentsatz aus. Daher sind die Werte der einzelnen Labore möglicherweise nicht direkt mit den hier vorgestellten vergleichbar, aber sie sollten ähnlich sein und den gleichen Trends folgen. Daher sollten Methoden und Verfahren zur Herstellung von ZLM, das ein Zn2+-begrenzendes Wachstum liefert, für jedes Labor- und Reinstwassersystem optimiert werden, und die hier vorgestellten Bioindikator-Phänotypen sollten als Standard zur Definition von Zn2+-begrenzenden Bedingungen verwendet werden.
Aufgrund der Schwierigkeit bei der Standardisierung und Reproduktion von Zn2+-begrenzten Wachstumsbedingungen besteht ein zugänglicher Ansatz zur Umgehung einer Zn2+-Kontamination darin, Medien, die ohne Zusatz von Zn2+ hergestellt wurden, einen Chelatbildner zuzusetzen. Dieser Ansatz verwirrt jedoch die wahre biologische Reaktion auf die Zn2+-Begrenzung und schafft oft eine Umgebung, die nach Zn2+ und anderen Mikronährstoffen hungert. Es wurde gezeigt, dass sogarZn 2+-spezifische Chelatbildner die Reaktion auf Eisenmangel hochregulieren, zusätzlich zu der Zn2+-abhängigen transkriptionellen Reaktion in M. tuberculosis23. Darüber hinaus erfordert die Verwendung von Chelatbildnern eine sorgfältige Titration und Timierung, um eine stark Zn2+-arme Umgebung zu vermeiden, die die biologische Reaktion während des Wechsels von Zn2+-reichen zu Zn2+-begrenzten Bedingungen oder das anhaltende Wachstum in Umgebungen mit begrenzter Verfügbarkeit von freiem Zn2+ nicht widerspiegelt. Schließlich ist die Zugabe von Chelatbildnern möglicherweise nicht mit nachgelagerten Anwendungen (z. B. Makrophagen oder Tierinfektionen) kompatibel. Grundsätzlich unterschiedliche Schlussfolgerungen wurden über die Form und Funktion von Alt-Ribosomen gezogen, die mit Chelatbildnern gewonnen wurden, im Vergleich zu einer allmählichen Zn2+-Depletion in aktiv wachsenden Kulturen17,24. Hier werden verschiedene Phänotypen hervorgehoben, die sich aus relativ geringen Unterschieden in der Wasserreinheit in verschiedenen Chargen von Medien ergeben, selbst wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird. Das hier vorgestellte quantifizierbare, reproduzierbare und biologisch relevante System zur Erzeugung von Alt-Ribosomen, d.h. in Zn2+-begrenzten Wildtyp-Kulturen ohne Zugabe von Chelatoren, bietet eine standardisierte Methode, die für die Vereinheitlichung der Beiträge auf dem gesamten Feld zu einem besseren Verständnis der alternativen Ribosomenbiologie von größter Bedeutung sein wird.

Zink-Ionen (Zn2+) sind ein essentieller Mikronährstoff und ein Standardbestandteil von mikrobiologischen Medien. Viele Bakterien ertragen jedoch eine Zn2+-Limitierung in der Umwelt, da Zn2+-limitierende Bedingungen weit verbreitet sind. soil1, marine2, und Nischen innerhalb der host3 sind oft Zn2+-begrenzt. Daher haben die meisten Bakterien Mechanismen entwickelt, um die Zn2+-Beschränkung zu überwinden und die zelluläre Funktion zu erhalten4. Systeme, die an der Aufrechterhaltung der Zn2+-Homöostase beteiligt sind, stehen unter strenger transkriptioneller Kontrolle5 und sind an der Abscheidung von Zn2+ unter Verwendung hochaffiner Zn2+-Importsysteme, der Mobilisierung zellulärer Zn2+-Reserven und dem Ersatz bestimmter Zn2+-bindender Proteine durch alternative Zn2+-unabhängige Paraloge6 beteiligt. Ein Beispiel für Letzteres sind Zn2+-unabhängige ribosomale Protein (RPs) Paraloge, die ein gemeinsames Merkmal von Zn2+-responsiven Regulons in Bakterien sind4. Diese hochdivergenten Zn2+-unabhängigen RPs unterscheiden sich von ihren Zn2+-bindenden Paralogen durch die Unterbrechung des Zn2+-bindenden CXXC-Motivs7. Mehr als die Hälfte der sequenzierten prokaryotischen Genome enthält mindestens ein Paar duplizierter RPs, wobei in vielen von ihnen ein RP Zn2+ bindet, während sein Paralog nicht class="xref">8 bindet. Während die C+/C-Notation (die das Vorhandensein/Fehlen des Cystein-reichen Zn2+-Bindungsmotivs anzeigt) häufig in Bezug auf diese paralogen RP-Paare verwendet wird7, wurden Zn2+-unabhängige RPs auch als alternative (Alt) Versionen der primären (Prim), Zn2+-bindenden RP-Paraloge beschrieben, da AltRPs als alternative RPs für die Ribosomenbiogenese im Zn2+ dienen-Eingeschränkter Zustand bei einigen Bakterien und es ist ein Schlüsselwort mit besserer Auffindbarkeit9,10,11.
Da die AltRP-Expression stark durch Zn2+ reguliert wird, ist es logisch anzunehmen, dass die AltRP-Expression angesichts der Zn2+-Limitierung funktionelle Redundanz zu Zn2+-abhängigen ribosomalen Proteinen bietet. In der Tat wurde diese Eigenschaft von AltRPs für das Modell-Bodenbakterium Bacillus subtilis demonstriert, bei dem das Wachstum während der Zn2+-Begrenzung durch Befreiung der Oberfläche PrimRP L31 und Ersatz durch das AltRP L31 gerettet wird12,13. Einige AltRPs sind jedoch paralog zu Kern-PrimRPs, z. B. S14, was bedeutet, dass ihr Einbau während der Ribosomenbiogenese erforderlich ist12,13. Der Wiederaufbau des Ribosoms mit AltRPs ist ein engagiertes, energieintensives Programm. Während diese Kern-AltRPs dazu dienen könnten, Zn2+ aus dem Ribosom zu befreien, ist es auch möglich, dass einige AltRPs in der Zn2+-begrenzten Umgebung eine zusätzliche Funktion entwickelt haben. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass AltRPs von ihren paralogen PrimRPs abweichen; Die Sequenzhomologie von AltRP-Genen ist bei Homologen in verschiedenen Spezies oft höher als bei der Zn2+-bindenden PrimRP-Gensequenz innerhalb derselben Spezies7,10. Da Gene, die für stark divergierende AltRPs kodieren, unter Zn2+-abhängiger transkriptioneller Kontrolle stehen, werden sie aus dem Selektionsdruck entfernt, der auf die streng regulierten und hochkonservierten ribosomalen Superoperonen ausgeübt wird14. Der entkoppelte Selektionsdruck auf die genetische Information, die für die ribosomale Maschinerie und die AltRPs kodiert, setzt diese RPs anderen Evolutionsverläufen aus als die homologen PrimRPs und könnte eine linienspezifische Evolution desselben AltRP in verschiedenen Bakterien ermöglichen10,15. Die weit verbreitete Existenz von AltRPs in Bakterien und die entkoppelte genetische Regulation dieser einzigartigen RPs wirft die interessante Frage auf, ob der Einbau von AltRPs in bakterielle Ribosomen AltRP-haltigen Ribosomen (Alt-Ribosomen) eine besondere Eigenschaft verleiht.
Mykobakterien sind eine ideale Gruppe von Bakterien, um die mechanistischen Eigenschaften von Alt-Ribosomen zu untersuchen. Erstens besitzen Mykobakterien ein hochkonserviertes AltRP-Operon, das vier Gene enthält, die für AltRPs kodieren: S14-2, S18-2, L28-2 und L33-28,9. Mykobakterielle AltRPs unterscheiden sich signifikant von ihren PrimRP-Paralogen; In allen vier PrimRP/AltRP-Paaren ist ein gegebenes AltRP-Gen über alle Mykobakterienarten hinweg ähnlicher als das PrimRP-Gen in derselben Spezies10. Die linienspezifische Evolution von AltRPs ist auch innerhalb von Mykobakterien offensichtlich, wie die AltRPs S18-2 und L28-2 in Mycobacterium tuberculosis und M. bovis zeigen, die einzigartige Sequenzen am C-Terminus enthalten, die in anderen Mykobakterien nicht vorhanden sind10. Zweitens enthält diese Gruppe hochgradig verwandter Bakterien nicht-pathogene und pathogene Mitglieder, die in verschiedenen Umgebungen leben, vom Boden (z. B. M. smegmatis) bis hin zu unzähligen Wirten: Mensch (z. B. M. tuberculosis), Rind (z. B. M. bovis), aquatisch (z. B. M. marinum) und Vogel (z. B. M. avium), um nur einige zu nennen. Die hochkonservierte Natur des altRP-Operons in Mykobakterien, die linienspezifische Evolution spezifischer AltRP-Gene und die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen Mitglieder dieser Gruppe existieren, bieten eine einzigartige Gelegenheit, die konservierte und linienspezifische Evolution der AltRP-Funktion und der mechanistischen Eigenschaften von Alt-Ribosomen zu analysieren. Trotz der Häufigkeit von AltRPs in prokaryotischen Genomen wurde die Rolle von AltRPs und Alt-Ribosomen nur in wenigen Bakterien untersucht9,10,11,12,13,16,17,18,19. Die Etablierung eines standardisierten Systems mit spezifischen Metriken zur Validierung von Zn2+-limitierenden Wachstumsbedingungen in Mykobakterien würde die experimentellen Ergebnisse verbessern und das Verständnis von Alt-Ribosomen im Bereich der Ribosomenforschung voranbringen.
Zn2+ ist ein Mikronährstoff; daher tragen Spuren von Verunreinigungen von Zn2+ in Chemikalien und Wasser zur Bioverfügbarkeit von Zn2+ bei, auch wenn sie in der Medienvorbereitung weggelassen werden. Die Spurenmengen von Zn2+, die in Wasser oder Chemikalien vorhanden sind, können von Labor zu Labor drastisch variieren, wodurch das Ergebnis des Zn2+-begrenzenden Wachstums beeinflusst wird. Die empirische Quantifizierung des [Zn2+] in jeder unabhängigen Herstellung von Medien ist für die meisten Laboratorien, die routinemäßige Wachstumsassays durchführen, übermäßig aufwändig, aber ein Mechanismus zur Beseitigung der Möglichkeit einer Zn2+-Kontamination in Wachstumsmedien wäre an sich wertvoll. Zu diesem Zweck wird hier ein detailliertes Verfahren zur Herstellung eines chemisch definiertenZn2+-begrenzten Mediums (ZLM), von Wachstumsgefäßen und Samenkulturen für das Zn2+-limitierende Wachstum und die Alt-Ribosomenproduktion in M. smegmatis und M. tuberculosis vorgestellt. Wichtige morphogene Merkmale (Zelldichte, gemessen mit OD600, Zelllänge und Fluoreszenz des Coenzyms F420) nach dem Wachstum in ZLM werden verwendet, um zu überprüfen, ob die Zn2+-Limitierung erreicht wurde. Coenzym F420 ist ein Deazaflavin-Cofaktor, der eine wichtige Rolle beim Katabolismus und bei der Abwehr von oxidativem Stress bei Methanogenen und Mykobakterien spielt20,21. Wichtig ist, dass Mykobakterien autofluoreszierend sind, wenn sie bei 420 nm angeregt werden, da dieser Cofactor22 häufig vorhanden ist. Die molekulare Bindung zwischen [Zn2+] und der F420-Fluoreszenz ist noch nicht geklärt, aber die Verfolgung der F420-Fluoreszenz in Kulturen ist ein handhabler und zuverlässiger Bioindikator.
In M. smegmatis treten die Bioindikator-Phänotypen in den Wildtyp-Bakterien auf, aber eine Deletionsmutante, der das altRP-Operon fehlt, durchläuft nicht das gleiche morphogene Programm und kann als differentieller Bioindikator verwendet werden10. Obwohl M. tuberculosis während der Zn2+-Limitierung nicht dem gleichen morphogenen Programm wie M. smegmatis folgt, hat M. tuberculosis eine robuste und globale Reaktion auf Zn2+ Einschränkung und ein Schlüssel-Bioindikator-Phänotyp nach dieser Methode23. Das hier definierte System ermöglicht somit die Erzeugung von Prim- und Alt-Ribosomen unter den gleichen Wachstumsbedingungen (d.h. Zn2+-Limitierung), was die mechanistische Aufschlüsselung der Alt-Ribosomenfunktion und ihrer Rolle bei der Gestaltung der bakteriellen Physiologie erleichtert. Diese Wachstumsmethode wurde verwendet, um die Struktur aktiver Alt-Ribosomen aufzuklären und ihre translationale Aktivität in Wildtyp-M. smegmatis24 zu demonstrieren. Ein weiterer Beleg dafür, dass diese Wachstumsmethode und dieser Bioindikator-Phänotyp die biologische Funktionalität von AltRPs während der Zn2+-Limitierung unterstreicht, ist, dass die AltRP-Expression für dieZn 2+-abhängige Morphogenese erforderlich ist und einen tiefgreifenden Einfluss auf das Transkriptom und Proteom von Zn2+-limitiertem M. smegmatis10,25 hat. Die gleiche Methode, mit geringfügigen Änderungen in der Menge des Inokulums und der Inkubationszeit, wird verwendet, um Zn2+-begrenzte Kulturen von M. tuberculosis zu erzeugen9,23. Hier werden Protokolle und Bioindikator-Phänotypen für das Erreichen eines Zn2+-begrenzenden Wachstums sowohl bei M. smegmatis als auch bei M. tuberculosis detailliert beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf M. smegmatis liegt, da dieses Bakterium empfindlicher auf Zn2+-Kontamination in den Medien reagiert und breiter zugänglich ist als der langsam wachsende Erreger.

<table><tbody><tr><td>1000 mL Vakuumfiltrationssysteme, Standard Line</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Erlenmeyerkolben</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Kulturröhrchen, Kunststoff, mit Dual-Position-Verschlüssen</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyerkolben</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X Labor Binokular Biologische Verbindung Mikroskop</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Bioreaktionsröhrchen, steril</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Hochleistungszentrifugenröhrchen mit Fahnenkappen</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet Schaumarmes Waschpulver</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumeisen (III)-citrat, braun</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 g/mol, für 1 M Lösung 1,325 g in 5 mL Reinstwasser geben; lichtgeschützt bei 4 °C lagern</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium-D-Pantothenat</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure wasserfrei, kristallin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Bouillon</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>DiluPhotometer OD600 zur Bestimmung der Zelldichte und Bradford-Assays</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Mikroplatten-Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td>Abgekündigtes</td></tr><tr><td>Glycerin Fisher</td><td>Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Multimode Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagin</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2147336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP CCD-Kamera</td><td>Optronik</td><td></td><td>Zur Verwendung mit dem Olympus-Mikroskop</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Direct 8 Wasseraufbereitungssystem</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>Eingestellt, ersetzt durch Moticam X5 Plus; zur Verwendung mit Verbundmikroskop</td></tr><tr><td>Ölsäure</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51 aufrechtes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Abgekündigt, ersetzt durch BX53M</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Mikro Zweiseitige Einweg-Kunststoffküvetten</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid, Kristall</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfid-Heptahydrat, kristallin/ACS</td><td>MP Biomedicals</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von mycobacterium smegmatis als bioindikator für zinkbegrenzte wachstumsbedingungen bei mykobakterien

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

Viele Bakterien bauen alternative Ribosomen unter Zn2+-limitierenden Wachstumsbedingungen auf, indem sie Zn2+-bindende ribosomale Proteine durch Zn2+-unabhängige Paraloge ersetzen. Die Definition eines Systems zur Untersuchung dieser alternativen Ribosomen hat sich als schwierig erwiesen, da Zn2+-Kontaminationen im Labor üblich sind. Um dieses Problem zu lösen, werden manchmal Chelatbildner zu Wachstumsmedien hinzugefügt, aber dieser Ansatz verwirrt die biologische Reaktion auf eine allmähliche Zn2+-Limitierung und ist mit dem Ribosomenschlaf verbunden. Im Folgenden finden Sie eine detaillierte Anleitung zur Vorbereitung von Medien und Aussaatkulturen für ein Zn2+-begrenztes Wachstum ohne Zugabe von Chelatoren. Nach dieser Methode durchläuft das Modellbakterium, Mycobacterium smegmatis, eine Morphogenese, die auf alternative Ribosomen angewiesen ist. Da die Morphogenese beherrschbar ist und nur unter Zn2+-limitierenden Bedingungen auftritt, kann M. smegmatis als Bioindikator zur Verifizierung biologisch relevanter Wachstumsbedingungen verwendet werden. Drei Bioindikator-Phänotypen (Zelldichte, Zelllänge und Coenzym F420-Fluoreszenz), die auf eine Zn2+-Limitierung im Wildtyp hinweisen, werden beschrieben, und Veränderungen in diesen Bioindikatoren für eine Deletionsmutante, die keine alternativen Ribosomen bilden kann, werden skizziert. Da die Spurenkontamination von Zn2+ für jede Mediencharge schwer zu kontrollieren ist und eine genaue Quantifizierung von Zn2+ in jeder Medienvorbereitung übermäßig aufwändig ist, ist die Verfolgung dieses Bioindikator-Phänotyps ein zugänglicher Weg, um die Aufbereitung von Zn2+-begrenzten Wachstumsmedien zu validieren. Um geeignete Bedingungen für das Zn2+-begrenzende Wachstum und die alternative Ribosomenproduktion zu identifizieren, wurden Veränderungen in den Bioindikator-Phänotypen auch für Zn2+-kontaminierte oder starkZn 2+-abgereicherte Zubereitungen von Zn2+-begrenzten Medien profiliert. Weitere Details zum Erreichen eines Zn2+-limitierenden Wachstums und einer alternativen Ribosomenproduktion in M. tuberculosis werden zusammen mit dem zugehörigen Bioindikator-Phänotyp vorgestellt. Insgesamt werden die hier beschriebenen detaillierten Anweisungen und Bioindikator-Phänotypen dazu beitragen, die Produktion von translational aktiven alternativen Ribosomen in Mykobakterien zu standardisieren.

Bioindikator-Phänotypen von M. smegmatis 
Wildtyp M. smegmatis Kulturen, die in ZLM gezüchtet werden und Zn erreichen2+wachstumseinschränkend haben drei Haupt-Bioindikator-Phänotypen im Vergleich zu Zellen, die unter Zn wachsen2+– reiche Bedingungen: [1] verminderte OD600, [2] längliche Zellen und [3] verminderte Fluoreszenzspitze bei 420 nm. Der Mutant, der AltRPs fehlt (ΔaltRP) hat nicht das gleiche Zn2+abhängige Morphogenese, wie beim Wildtyp10, und sein einzigartiges Phänotyp in Zn2+-begrenzte Medien können als differentieller Bioindikator verwendet werden. Daher sollten alle drei Bioindikator-Parameter zunächst an Wildtypen, die in ZRM und ZLM gezüchtet wurden, evaluiert werden. Wenn der erwartete Zn2+– ein eingeschränkter Wildtyp-Phänotyp wird beobachtet, der ΔaltRP Der Deletionsstamm sollte anschließend evaluiert werden. Ein Wachstum in ZLM erreicht nicht immer Zn2+-begrenzte Bedingungen, was genau der Grund ist, warum Bioindikatoren benötigt werden. Einzigartige Wildtyp- und ΔaltRP Bioindikator-Phänotypen verifizieren, dass biologisch relevante Zn2+begrenzende Bedingungen wurden erreicht. Wenn Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, kein Zn erreichen2+wachstumsbegrenzend aufgrund von Zn2+ Kontamination in dem Medium oder den Kulturgefäßen (ZLM-C) werden diese Bioindikator-Phänotypen weniger ausgeprägt sein, wie gezeigt in Abbildung 1 und Abbildung 2. Umgekehrt, wenn die Konzentration von Zn2+ in ZLM ist zu niedrig, wird das Wachstum durch Zn beeinträchtigt2+ Ausschöpfung (ZLM-D), die sich in einer geringen Kulturtrübung und veränderten Bioindikator-Phänotypen zeigt, ebenfalls beschrieben in Abbildung 1 und Abbildung 2.
Die Zelldichte ist ein aussagekräftiges Maß für die Zn2+-Limitierung. Kulturen, die in ZRM gezüchtet werden, erreichen nach 72 h stets eine hohe Trübung (über einem OD600 von 5), möglicherweise mit Zellklumpenbildung, und erscheinen sichtbar gelber (Daten nicht gezeigt) als Kulturen in ZLM (Abbildung 1A). Die Zn2+-Limitierung hemmt das Wachstum (gekennzeichnet durch verminderten OD600) aller Stämme im Vergleich zur Zn2+-reichen Bedingung, wobei der ΔaltRP-Stamm eine geringere Zelldichte als der Wildtyp aufweist (Abbildung 1A). Zn2+-limitierendes Wachstum in ZLM führt beim Wildtyp stets zu einem OD600 von über 3,5 und unter 5, beim ΔaltRP-Stamm hingegen zu einem Wert unter 3 (Abbildung 1A). Kulturen in ZLM mit Zn2+-Kontamination (ZLM-C) erreichen eine ähnliche Zelldichte (OD600 über 5) wie Zn2+-reiche Kulturen in ZRM (Abbildung 1A). Falls die [Zn2+] in ZLM zu niedrig ist, werden die Kulturen stark an Zn2+ verarmt (ZLM-D), und das Wachstum ist beeinträchtigt, was sich in einer verminderten Zelldichte der Wildtyp-Kulturen zeigt (OD600 unter 3; Abbildung 1A). Die Zelldichte des Wildtyps (3,5 &lt; OD600 &lt; 5) sollte als erster bioindikativer Phänotyp-Prüfpunkt dienen, um Zn2+-limitierende Bedingungen zu bestätigen. Nur Wildtyp-Kulturen, die die erwartete Zelldichte erreichen, sollten berücksichtigt werden; die Analyse des ΔaltRP-Stamms sollte erst nach der Bestätigung des Zn2+-limitierten bioindikativen Phänotyps im Wildtyp erfolgen.
Stationäre Wildtyp-Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, das an Zn2+ arm ist, weisen eine Verlängerung auf und haben eine durchschnittliche Zelllänge von etwa 9 µm, während Zn2+-reiche Kulturen, die in ZRM gezüchtet wurden, kurz sind und eine durchschnittliche Zelllänge von etwa 3 µm aufweisen (Abbildung 1B). Wildtyp-Kulturen, die in ZLM mit Zn2+-Verunreinigung (ZLM-C) gezüchtet wurden, verlängern sich nicht vollständig, sind aber etwas länger als Zn2+-reiche Zellen, mit einer durchschnittlichen Zelllänge von 5 µm. Die Bioindikation von Zn2+-Verunreinigungen in kompletten ZLM-Partien deutet auf eine mögliche Kontamination während der Herstellung hin, während bei Einzelkulturen (d. h. Kolben) eine Kontamination auf unsachgemäßes Spülen der Kolben oder Fehler bei der Kulturpräparation zurückzuführen ist. Wildtyp-Kulturen, die in stark Zn2+-verarmtem ZLM (ZLM-D) gezüchtet wurden, zeigen eine weniger ausgeprägte Verlängerung mit einer durchschnittlichen Zelllänge von etwa 7 µm (Abbildung 1B). Das verlängerte Wildtyp-Phänotyp wird bei dem ΔaltRP-Stamm nicht beobachtet, und ΔaltRP-Zellen, die an Zn2+ limitiert sind, weisen eine durchschnittliche Zelllänge von etwa 5 µm auf (Abbildung 1B). Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder von Zellen, die in verschiedenen Zubereitungen von ZLM oder ZRM gezüchtet wurden (gemäß Schritt 2) und mit einem zusammengesetzten Lichtmikroskop sichtbar gemacht wurden. Im Anschluss an Schritt 4 werden Zellen aus mehreren Bildausschnitten wie in Abbildung 2 dargestellt, um die durchschnittliche Zelllänge der in Abbildung 1B gezeigten Kulturen zu berechnen. Das verlängerte Wildtyp-Phänotyp ist spezifisch für Zn2+-limitierende Bedingungen; eine zelluläre Verlängerung wird nicht beobachtet, wenn die Kulturen Zn2+-reich oder stark Zn2+-verarmt sind (Abbildung 1B und Abbildung 2).
Das Phänotyp-Merkmal der verringerten F420-Fluoreszenz als Bioindikator ist am besten in Fluoreszenzscans zu beobachten (Abbildung 1C). Die verringerte Fluoreszenz des Cofaktors F420 wird quantifiziert, indem der Prozentsatz der Fluoreszenzintensität bei 375 nm (Hintergrund) im Verhältnis zu 420 nm (Autofluoreszenz des Cofaktors F420) berechnet wird, wie in Schritt 3.16.5 beschrieben, angegeben als F375/420. Für monochromatische Plattenlesegeräte ohne Scanning-Fähigkeit eignen sich Einzelmessungen bei 375 nm und 420 nm (jeweils mit Emission bei 475 nm), um F375/420 zu berechnen. Wildtyp-Kulturen, die unter Zn2+-reichen Bedingungen (d. h. in ZRM) gezüchtet wurden, weisen einen hochgradig reproduzierbaren F375/420-Wert von etwa 17 % auf (Abbildung 1D). Eine Verringerung der F420-Fluoreszenz in Zn2+-limitierten Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, zeigt sich durch einen Anstieg des F375/420-Werts auf etwa 27 % (Abbildung 1D). Die F420-Fluoreszenz des Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamms ist unter denselben Bedingungen bemerkenswert geringer als beim Wildtyp, was in den Fluoreszenzscans visuell deutlich wird (Abbildung 1C). Der F375/420-Wert ist im Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamm stärker variabel, mit einem Bereich von etwa 50–80 % (Abbildung 1D). Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, jedoch Anzeichen einer Zn2+-Kontamination aufweisen (ZLM-C), zeigen einen reduzierten F375/420-Wert von etwa 21 %, während Kulturen, die Zn2+-erschöpft sind (ZLM-D), einen F375/420-Wert von etwa 35 % aufweisen (Abbildung 1D).
Zusammenfassend sollten drei Bioindikator-Phänotypen im Wildtyp und im ΔaltRP-Stamm untersucht werden, um den Zn2+-limitierten Status von Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, zu bestätigen. Die Bioindikatoren sollten bei biologisch relevanter Zn2+-limitierter Wachstumsbedingung wie folgt lauten: [1] Die OD600 des Wildtyps liegt zwischen 3,5 und 5, während die des ΔaltRP-Stamms unter 3 liegt, [2] Wildtyp-Zellen sind etwa 10 µm lang, während die Zellen des ΔaltRP-Stamms die halbe Länge aufweisen, und [3] das F375/420 des ΔaltRP-Stamms ist hoch, d.h. über 50 %.
Bioindikator-Phänotypen von M. tuberculosis 
Zn2+-begrenzt M. tuberculosis zeigt nicht dasselbe morphogenetische Programm wie M. smegmatis. Genauer gesagt besteht kein Unterschied in der OD600 zwischen Zn2+-reich und Zn2+-begrenzte Kulturen und Zn2+-begrenzte Kulturen zeigen kein offensichtliches morphologisches Phänotyp aus, d. h., sie verlängern sich nicht23. Ebenso gibt es kein Zn2+-verarmtes Bioindikator-Phänotyp (d. h. verminderte Zelldichte) in M. tuberculosis wie beobachtet wird bei M. smegmatis. Zn2+-begrenzte Kulturen weisen im Vergleich zu Zn stärkeres Klumpen auf2+-replete Kulturen, obwohl beide Bedingungen am Tag 10 erheblich verklumpt sind (beobachtet sowohl bei Mtb-H37Rv als auch bei Mtb-Aux). Das entscheidende bioindikatorische Phänotyp für Zn2+ Einschränkung in M. tuberculosis verringerte Peak-F420 Fluoreszenz, wie zuvor beschrieben23. Die Ergebnisse für Kulturen, die 8 Tage lang gezüchtet wurden, werden hier anstelle von 10 Tagen dargestellt, um Klumpenbildung zu minimieren. Verminderte F420 Fluoreszenz ist in Zn sichtbar2+-begrenzte Kulturen mit monochromatischem (Abbildung 3) und Filterplattenlesegeräte. Bei Filterplattenlesegeräten unter Verwendung von Mtb-H37Rv, Zn2+Kulturen unter begrenzenden Bedingungen (d. h. in ZLM gezüchtet) weisen etwa 50 % der Rohfluoreszenzwerte im Vergleich zu Zn auf2+-replete Kulturen (d. h. in ZRM gezüchtet; Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung eines monochromatischen Plattenreaders im Bottom-Reading-Modus und Mtb-Aux, Zn2+-reiche Kulturen weisen F auf375/420 rund 75 % und Zn2+-verunreinigte ZLM-Kulturen weisen ähnliche Werte auf. Vermindertes F420 Fluoreszenz in Zn2+-begrenzte Kulturen, die in ZLM gezüchtet werden, spiegeln sich in F wider375/420 von über 100 %. Das Zn2+-begrenzt ΔaltRP Stamm weist ein ähnliches Wachstum und F auf420 Fluoreszenz, wie sie im Zn zu sehen ist2+-begrenzter Wildtyp (Abbildung 3) und eignet sich nicht als Bioindikator in M. tuberculosis da es in M. smegmatis (Abbildung 1). Daher empfiehlt es sich, Medien zu testen, die zur Kultivierung verwendet werden sollen M. tuberculosis mit dem schnell wachsenden M. smegmatis
<img alt="Wachstumskurven, Längenverteilung und Fluoreszenzanalyse in bakteriellen Studien; Diagramme und Boxplots." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Bioindikator-Phänotypen von M. smegmatis unter Zn2+-Limitierung sowie die Wirkung von Zn2+-Kontamination und Zn2+-Ausschöpfung auf die Phänotypen. Vertretende Beispiele der in jeder Abbildung dargestellten Bioindikator-Phänotypen stammen aus denselben Kulturen nach 72 h. Beispiele für Wachstumsergebnisse unter Zn2+-Kontamination (ZLM-C), Zn2+-Limitierung (ZLM-L) und Zn2+-Ausschöpfung (ZLM-D) stammen aus unabhängigen Mediumzubereitungen, die alle dem hier beschriebenen Zubereitungsverfahren folgten (Schritt 2). Die repräsentativen Phänotypen für den Zn2+-limitierten Wildtyp und den ΔaltRP-Stamm stammen aus derselben Charge von ZLM. Alle Stämme und Bedingungen umfassen drei biologische Wiederholungen (n=3). (A) Wachstumskurven, die die optische Dichte bei 600 nm (OD600) zeigen, sowie die abnehmende Zelldichte bei Zn2+-Limitierung und -Ausschöpfung. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung zwischen den Wiederholungen. (B) Zelllängen der Wildtyp- und ΔaltRP-Stämme, die den verlängerten Phänotyp des Zn2+-limitierten Wildtyps veranschaulichen. Der Box-und-Whisker-Plot zeigt den Interquartilsabstand, Minimum, Maximum und Median der Zelllängen in µm. (C) Repräsentative Fluoreszenzscans von Kulturen, die eine verringerte F420-Fluoreszenzspitze bei Zn2+-Limitierung und eine weiter reduzierte F420-Fluoreszenz im Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamm zeigen. Es ist jeweils nur eine repräsentative Kultur aus den biologischen Triplikaten jeder unterschiedlichen Mediumzubereitung dargestellt. Die Fluoreszenzscans verwenden einen Anregungsbereich von 230 nm bis 440 nm mit 5-nm-Schrittweite und eine Emissionswellenlänge von 475 nm. Der eingeblendete Ausschnitt oben links zeigt eine vergrößerte Ansicht der Zn2+-limitierten Wildtyp- und ΔaltRP-Stämme, um die verringerte Fluoreszenzspitze bei 420 nm im Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamm hervorzuheben. Die Achseneinheiten entsprechen denen des Hauptdiagramms. Alle Legenden sind identisch zu (A). (D) Quantifizierung der verringerten Fluoreszenz des Cofaktors F420, berechnet als Prozentsatz von F375/420. Die Prozentsätze wurden aus den Werten der Fluoreszenzscans in (C) ermittelt. Der Box-und-Whisker-Plot zeigt den Interquartilsabstand, Minimum, Maximum und Median der Prozentsätze. Abkürzungen für den Zn2+-bezogenen Status des Mediums, die in Klammern nach dem Medientyp angegeben sind: R = Zn2+-reicher, C = Zn2+-kontaminiert, L = Zn2+-limitiert, D = Zn2+-ausgeschöpft; weitere Abkürzungen: WT = Wildtyp-Stamm, a.u. = beliebige Einheiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Ergebnisse der Zn²⁺-Status-Elektrophorese, WT im Vergleich zu ΔaltRP, Proteinseparationsanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: Repräsentative Mikroskopiebilder von M. smegmatis nach 72 h. Die Aufnahmen stammen von Kulturen, die in Abbildung 1 gezeigt werden. Die Zellen wurden mit einem Lichtmikroskop bei 1000facher Gesamtmagnifizierung unter Verwendung eines 100fachen Öl-Immersion-Objektivs abgebildet. Maßstabsbalken entsprechen 10 µm. Abkürzungen, die den Zn2+-relevante Status des Mediums in Klammern nach dem Medientyp angeben, sind: R = Zn2+-reich, C = Zn2+-kontaminiert, L = Zn2+-limitiert und D = Zn2+-erschöpft; weitere Abkürzungen: WT = Wildtyp-Stamm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Diagramm des Fluoreszenzanregungsspektrums; Wellenlänge vs. Fluoreszenz; Analyse von Proteinstudien." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3: Verlust des F420-Bioindikator-Phänotyps in Zn2+-limitiertem M. tuberculosis, dargestellt durch repräsentative Fluoreszenzmessungen des auxotrophen Mtb mc26206 (Mtb-Aux). Beispiele für Zn2+-kontaminierte und Zn2+-limitierte Wachstumsergebnisse stammen aus unabhängigen Medienzubereitungen. Die Zn2+-limitierten Stämme vom Wildtyp und ΔaltRP stammen aus derselben Charge von ZLM. Alle Stämme und Bedingungen umfassen drei biologische Wiederholungen (n=3). Im Diagramm ist jeweils nur eine repräsentative Kultur aus den biologischen Triplikaten jeder unterschiedlichen Medienzubereitung und jedes Stammes dargestellt. Die Fluoreszenzmessungen wurden im Bottom-Reading-Modus nach 8 Tagen Wachstum mit einem Anregungs-Wellenlängenbereich von 230 nm bis 440 nm und einer Schrittgröße von 5 nm sowie einer Emissionswellenlänge von 475 nm durchgeführt. Die Abkürzungen, die den Zn2+-bezogenen Status des Mediums in Klammern nach dem Medientyp angeben, bedeuten: R = Zn2+-reich, C = Zn2+-kontaminiert, L = Zn2+-limitiert und D = Zn2+-erschöpft; weitere Abkürzungen sind: WT = Wildtyp-Stamm, a.u. = beliebige Einheiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Zn2+-begrenzten Medien, Wachstumsgefäßen und Samenkulturen zur Produktion von Zn2+-begrenzten Ribosomen in Mykobakterien. Spuren von Zn2+ führen zu Zn2+-limitierendem Wachstum und wir beschreiben morphogene Merkmale, die als Bioindikatoren verwendet werden, um die Zn2+-Begrenzung in vitro im Modellbakterium Mycobacterium smegmatis und dem humanpathogenen M. tuberculosis zu verifizieren.

Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

using-mycobacterium-smegmatis-as-bioindicator-for-zinc-limited-growth

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mycobacterium tuberculosis bildet Wirkstoff toleranten Biofilme, wenn unter bestimmten Bedingungen kultiviert. Hier beschreiben wir Verfahren zur Kultivierung von M. Tuberkulose Biofilmen und die Bestimmung der Häufigkeit des Drogenkonsums tolerant persisters. Diese Protokolle werden für weitere Studien sinnvoll in die Mechanismen der Verträglichkeit der Medikamente in M. Tuberkulose.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Aktuelle Diagnostik antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung beruht auf der Plankton-Wachstum von Isolaten in nährstoffreichen, aeroben Bedingungen. Hier beschäftigen wir eine Alternative künstliche Sputum mittel-bis Antimikrobielle Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa Biofilmen unter aeroben und mikroaerophilen Bedingungen mehr repräsentativ für die Mukoviszidose-Lunge zu untersuchen.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

Quelle: Gupta, S., et al. Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, die von eisenlimitierten Mykobakterien produziert werden. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter eisenbeschränkten Bedingungen, um Eisenstress zu induzieren und die Sekretion von Siderophoren zu fördern, die das Überleben der Bakterien unterstützen.

Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter eisenbeschränkten Bedingungen

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Das charcoal agar resazurin assay (CARA) ist eine semiquantitative Methode mit mittlerem Durchsatz zur Beurteilung der Aktivität von Testmitteln gegen Mykobakterien, die replizieren, nicht replizieren oder beides.  Der CARA ermöglicht eine schnelle Bewertung der zeit- und konzentrationsabhängigen Aktivität und identifiziert Parameter, die mit Assays für koloniebildende Einheiten (KBE) verfolgt werden sollen.

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

Mycobacterium tuberculosis zeigt eine erhöhte Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikeln als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung niedriger Eisenbedingungen und Methoden zur Reinigung und Charakterisierung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel, die als Reaktion auf Eisenmangel freigesetzt werden.

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln, die von eisenbegrenzten Mykobakterien hergestellt werden

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Entwicklung eines Pellikel-Biofilms. Die Methode ist auf verschiedene Kulturvolumina skalierbar und ermöglicht eine einfache Anwendung für verschiedene experimentelle Ziele. Das Methodendesign ermöglicht eine qualitative oder quantitative Bewertung des biofilmbildenden Potenzials mehrerer Mykobakterienarten.

Wachsender mykobakterieller Biofilm als Modell zur Untersuchung von Antibiotikaresistenzen

In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Mycobacterial pathogenen Strategien noch schwer abzuschätzen. Das langsame Wachstum der meisten Arten, die undurchdringliche Natur der Zellwand, und die Gefahren bei der Arbeit mit Erregern machen Mykobakterien schwer zu untersuchen und sind weitgehend verantwortlich für unsere armen Verständnis dieser Organismen. In diesem Video zeigen wir Ihnen die Technik der Elektroporation, die Unterwerfung Zellen beinhaltet einen kurzen hohen elektrischen Impuls, um den Eintrag von DNA ermöglichen. Es ist...

Elektroporation von Mykobakterien

Erfahren Sie, wie Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien dient. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zur bakteriellen Physiologie und Pathogenese.

Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien

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