Name: Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Lernen Sie die Zwei-Photonen-Laserablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven kennen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Knochenregeneration und Immunantwort in vivo.

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Das Prüfprotokoll wurde von der Landesdirektion Sachsen genehmigt, Zulassungsnummern 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Die verwendeten Zebrafischstämme wurden gemäß den nationalen Rechtsvorschriften und unter standardisierten Bedingungen, wie bereits beschrieben, gehalten27,28. Die Einzelheiten zu allen Reagenzien und der Ausrüstung, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung von Materialien und Lösungen
<ol><li>Bewahren Sie die Embryonen in 1x E3-Medien auf. Bereiten Sie das 1x E3-Medium vor, indem Sie 170 mL eines 60x E3-Stoffes in 10 l entionisiertem Wasser verdünnen und 2 mL 0,1 % Methylenblau hinzufügen.<ol><li>Bereiten Sie das 60x E3-Medienmaterial vor, indem Sie 17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,90 g CaCl2,2 H2O, 4,90 g MgSO4,7 H2O in 1 l entionisiertem autoklaviertem Wasser mischen.</li>
	</ol></li>
	<li>Für die Einbettung der Larven Aliquots aus 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMA) im Voraus vorbereiten und bei Raumtemperatur aufbewahren.<ol><li>Zur Herstellung von Aliquoten lösen Sie LMA in 1x E3-Medien auf, z. B. 500 mg LMA in 50 mL 1x E3 in einem Erlenmeyerkolben, erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat, und geben Sie sie in 1 mL Aliquots in 1,5 mL Röhrchen ab.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zucht von Zebrafischen und Entnahme von Embryonen
HINWEIS: Doppelte transgene Zebrafischlarven, die das Vorhandensein von engagierten Osteoblasten [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 und Makrophagen [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] berichteten, wurden hier verwendet30 (Abbildung 1A).
<ol><li>Setzen Sie Elternzebrafische mit den gewünschten Einzeltransgenen am Abend vor der Paarung in Standard-Paarungskäfige ein. HINWEIS: Standard-Paarungskäfige ermöglichen es, die Eier in ein unteres Fach zu gelangen, wo der Zebrafisch sie nicht erreichen kann.<ol><li>Halten Sie Männchen und Weibchen bis zur Paarung mit einer Trennwand im Paarungskäfig getrennt. Entfernen Sie die Trennwand am Morgen des nächsten Tages, um die Paarung einzuleiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Spätestens mittags nehmen Sie die elterlichen Zebrafische aus den Aufzuchtbecken und sammeln die Embryonen, wobei Sie das Wasser aus dem Paarungskäfig durch ein Sieb abseihen. HINWEIS: Falls das genaue Alter der Larven entscheidend ist, entnehmen Sie die Embryonen in regelmäßigen Abständen von ca. 30 Minuten. Kupplungsverbindungen sollten in Experimenten mit verschiedenen Versuchsgruppen verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie die Embryonen in eine Schale mit einem Durchmesser von 100 mm, die 1x E3-Medium enthält, und bewahren Sie sie in einem Inkubator bei 28 °C31 auf.</li>
	<li>Entfernen Sie unbefruchtete Eizellen und tote Embryonen mit Hilfe eines Stereomikroskops mit einer Plastikpipette aus der Schale und wechseln Sie täglich 1x das E3-Medium.</li>
	<li>Sortieren Sie vor dem Experiment Larven, die positiv für die Reportertransgene sind, mit einem Fluoreszenzstereomikroskop.</li>
</ol>3. Einbettung von Larven in niedrigschmelzende Agarose
<ol><li>LMA-Aliquote werden in einem Thermoblock oder Wasserbad bei 65 °C geschmolzen. Sobald das LMA geschmolzen ist, halten Sie es bis zum Einbetten bei 42 °C (Abbildung 1B). Fügen Sie 50 μl 0,4 % MS-222 zu den geschmolzenen 1 ml LMA-Aliquot hinzu, um eine Konzentration von 0,02 % MS-222 für die Anästhesie zu erreichen.</li>
	<li>Narkose 4 dpf (Tage nach der Befruchtung) Larven (oder ältere Larven) in 0,02% MS-222 E3 Medien.</li>
	<li>Übertragen Sie die anästhesierten Larven mit einer 3-ml-Pasteur-Kunststoffpipette in eine Mikrotiterschale mit Glasboden und entfernen Sie das überschüssige E3-Medium mit derselben Pipette (Abbildung 1B). Vermeiden Sie das Austrocknen der Larven. HINWEIS: Es können mehr als eine Larve gleichzeitig in eine Schale eingebettet werden. Es wird empfohlen, 3 bis 5 Larven einzubetten, um genügend Zeit für die Platzierung zu haben.</li>
	<li>Nehmen Sie die geschmolzene LMA-Agarose aus dem Wasserbad/Thermoblock und geben Sie einen (kühlenden) Tropfen LMA in die Schale, wobei Sie den Glasboden bedecken, auf dem die Larven positioniert waren. Achte darauf, dass der LMA nicht zu heiß, aber trotzdem flüssig ist.</li>
	<li>Setzen Sie dann die Larven in die gewünschte Seitenlage, bevor sich die Agarose verfestigt. Achten Sie hier auf eine seitliche Position, in der sich der Operkel so nah wie möglich am Glasboden der Schale befindet, als Vorbereitung für den Aufbau des inversen Mikroskops (Abbildung 1B).</li>
	<li>Lassen Sie die Agarose fest werden und geben Sie dann E3-Medien (mit maximal 0,02 % MS-222) in die Schale, um ein Austrocknen der Agarose zu vermeiden (Abbildung 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Einbettungsverfahrens. (A) Doppeltransgenes Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 wurden Zebrafischlarven mit grün markierten operkulären Osteoblasten und Makrophagen mit roter Markierung verwendet. (B) Der Arbeitsablauf des Einbettungsverfahrens, wie in Schritt 3 des Protokolls beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
4. In-vivo-Bildgebung der Larven und Laserablation
<ol><li>Zur Laserablatation von Osteoblasten im sich entwickelnden Operkel des transgenen Zebrafisches Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, verwenden Sie ein inverses Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 25x/0,95 Wasserobjektiv oder einem gleichwertigen Aufbau.</li>
	<li>Platzieren Sie die Schale mit den eingebetteten Larven auf dem mikroskopischen Tisch am inversen Mikroskop und positionieren Sie die gewünschte Region für die Ablation in der Mitte des Gesichtsfeldes. Der Operkel kann mit Hilfe des GFP-Fluoreszenzsignals leicht identifiziert werden.</li>
	<li>Sobald der Operkel fokussiert und im Sichtfeld des Mikroskops zentriert ist, wählen Sie die Z-Stapel-Einstellungen (oft werden Z-Intervalle von 1-2 μm verwendet), um die gesamte Breite des Operkels abzubilden. Wählen Sie gleichzeitig den Bereich in einer bestimmten Z-Ebene, der abgetragen werden soll (normalerweise in der hinteren Zone des Operkels). Die Zwei-Photonen-Laserablation wird nur in dieser Ebene durchgeführt. HINWEIS: Eine höhere Auflösung in der z-Dimension führt zu längeren Bildgebungszeiten, ermöglicht aber später volumetrische Analysen der erfassten Daten.</li>
	<li>Bilden Sie den interessierenden Bereich des Operkels vor der Ablation ab. Verwenden Sie für die GFP-Detektion einen Weißlichtlaser bei 488 nm und einen Hybriddetektor im Bereich von 495 nm bis 550 nm oder gleichwertig. Bilden Sie die Makrophagen mit einer 555-nm-Anregung (Weißlichtlaser) mit einem mCherry-Nachweisbereich von 595 bis 780 nm auf einem Hybriddetektor (oder einem gleichwertigen Detektor) ab.<ol><li>Verwenden Sie das Bildformat 512 x 512 für ein gutes Qualitäts-Zeit-Verhältnis (andere Formate können verwendet werden, wenn eine höhere Auflösung oder alternativ eine höhere Geschwindigkeit gewünscht wird). HINWEIS: Ein am Mikroskop installierter temperaturgesteuerter Inkubator kann verwendet und z. B. auf 28 °C eingestellt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Zeichnen Sie einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 25 μm (andere Formen und Größen können je nach Experiment ausgewählt werden) in einer ausgewählten 2D-Ebene und fokussieren Sie das Operkel mit dem ROI-Werkzeug.</li>
	<li>Um die Ablation durchzuführen, wenden Sie eine Ablationsleistung (ohne Objektiv gemessen) bei 450 mW an und belichten Sie den ausgewählten Bereich mit einer Scangeschwindigkeit von 400 Hz und einer Gesamtdauer von 10 s dem Zwei-Photonen-Laser. Während der Ablation kann der Bereich mit einem Hybriddetektor im Bereich von 401-443 nm oder gleichwertig sichtbar gemacht werden.</li>
	<li>Bestätigen Sie nach der Ablation die Ablation strukturell, indem Sie denselben Z-Stapel mit den gleichen Einstellungen wie vor der Ablation erneut abbilden. Der abgetragene Bereich enthält keine fluoreszierenden Zellen mehr.</li>
</ol>5. Bergung von Larven und Bildgebung zur Überwachung der Rekrutierung von Immunzellen
<ol><li>Wenn die Bildgebung der Rekrutierung von Immunzellen mit Verzögerung durchgeführt werden muss, erholen Sie die Larven aus der Bildgebung und der Anästhesie. Entnehmen Sie die Larven vorsichtig mit einer Pinzette oder einer Seziernadel aus dem LMA.<ol><li>Entfernen Sie zunächst eine Schicht Agarose, die die Larven bedeckt. Zweitens entfernen Sie die Agarose, die in direktem Kontakt mit den Larven steht. Lassen Sie diesen Schritt aus, wenn eine unmittelbare Bildgebung der Rekrutierung von Immunzellen stattfindet.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die Larven zurück in eine Schale mit reinem E3-Medium und überprüfen Sie ihre Erholung. Die Genesung zeigt sich durch das Schwimmen der Larven.</li>
	<li>Bei 4 oder 6 hpl (Stunden nach der Läsion) wird der Operkelbereich erneut mit den gleichen Einstellungen am selben Mikroskop abgebildet, um die Auswirkungen der Ablation auf die Makrophagenrekrutierung zu überprüfen. Wiederholen Sie dazu das Einbetten (Schritt 3) und das Imaging wie zuvor (Schritt 4).</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Bildgebung die Larven aus dem LMA. Die Opferung der Larven kann je nach gesetzlichen Vorgaben entweder durch Inkubation in Eiswasser oder mit einer Überdosierung von MS-222 in E3 erfolgen. Die Proben können dann für Folgestudien verwendet oder entsorgt werden.</li>
</ol>6. Bildanalyse und statistische Analyse
<ol><li>Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware wie z.B. Fiji32. Abhängig von der Z-Auflösung der erfassten Daten können Analysen in 2D oder 3D durchgeführt werden.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Makrophagen manuell, indem Sie entweder Zellen einbeziehen, die klar voneinander getrennt sind, z. B. durch Unterscheidung der Hauptzellkörper, oder alternativ durch Quantifizierung von Zellen mit einer Kernmarkierung oder durch Messung der Fläche, falls sich Zellen überlappen (nächster Schritt).</li>
	<li>Zur Quantifizierung der Fläche erstellen Sie eine Maske, die die Makrophagen umfasst. Verwenden Sie dazu das Tool Image &gt; Adjust &gt; Threshold und erstellen Sie einen ROI (Analyze &gt; Tools &gt; ROI Manager &gt; Add) in Fidschi. Schließen Sie kleine Partikel im Hintergrund zur Quantifizierung aus.<ol><li>Messen Sie dann die Fläche (Analysieren &gt; Messen). Überlegen Sie, ob Bereiche mit überlappender zellulärer Fluoreszenz in die Messung einbezogen werden müssen. HINWEIS: Hier wurde die zirkuläre Ablationsfläche bei den Flächenmessungen weggelassen, da rekrutierte Makrophagen in diesem Bereich nicht unterschieden werden können.</li>
	</ol></li>
	<li>Erstellen Sie Diagramme, die die Messergebnisse mit geeigneter Software darstellen. Um die Daten vor und nach der Ablation zu vergleichen, führen Sie einen entsprechenden statistischen Test durch (hier wurde ein gepaarter einseitiger t-Test durchgeführt). HINWEIS: Die Figuren können mit Hilfe von Fotobearbeitungs- und Grafikdesign-Software vorbereitet werden.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Laserablationsmethode zur Untersuchung der Knochenregeneration bei Zebrafischlarven

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<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat, CaCl2&middot; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale, PS, 100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>Spitzenform gerade, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm</td></tr><tr><td>Falcon 6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterschale mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td>35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 14 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet</td></tr><tr><td>Insight X3 Multiphotonenlaser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td><td>LAS X, Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niedrigschmelzende Agarose&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Plaque Agarose</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat Heptahydrat, MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Gegenkäfige</td><td></td><td></td><td>viele Varianten, z.B. Tecniplast</td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid, NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 FALKE</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Ausgestattet mit einem Insight X3 Multiphotonenlaser und Leica Application Suite Software</td></tr><tr><td>Edelstahl-Präpariernadel</td><td>Bochem</td><td>12010</td><td>140 mm</td></tr><tr><td>Stereomikroskop System SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>Ausgestattet mit einem LED-Beleuchtungssockel SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>Thermostatschränke TS - WTW</td><td>xylem</td><td>TS 608/2-i</td><td>Für die Inkubation (Embryo)</td></tr><tr><td>Transfer Pipette, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm, LD-PE, transparent</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 Version 4.7.1.0.</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ausgestattet mit Axiocam MRm Kamera und AxioVision Software</td></tr></tbody></table>

zwei-photonen-laser-vermittelte ablation von osteoblasten in sich entwickelnden zebrafischlarven

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

Die Laserablation wurde wie im obigen Protokoll angegeben durchgeführt. Das GFP-Signal der Osteoblasten im ablierten Bereich verschwand sofort nach der Ablation. Um die Reaktion der Osteoblastenablation in Bezug auf die Immunantwort zu untersuchen, wurde das Vorhandensein von Makrophagen in 6 dpf Larven vor und bei 6 hpl abgebildet. Vor der Ablation wurden nur sehr wenige Makrophagen im Operkelbereich10 beobachtet (Abbildung 2). Bei 6 hpl wurde eine starke Akkumulation von Makrophagen in der ablierten Operkelregion und eine erhöhte Anzahl von Makrophagen im Gesichtsfeld, einschließlich des Operkels und des Bereichs um den Operkel, nachgewiesen10 (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Makrophagenrekrutierung bei 6 hpl in 6 dpf Zebrafischlarven. Operkelbereich ohne Ablation und bei 6 hpl. Operkuläre Osteoblasten sind grün markiert, Makrophagen magenta, und der gestrichelte Kreis zeigt den laserablierten Bereich. Maßstab: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Rekrutierung von Makrophagen wurde auch bei 4 dpf Larven mit viel kleineren Operkeln bei 4 hpl analysiert, wobei ähnliche Ergebnisse beobachtet wurden (Abbildung 3). Die Quantifizierung der Makrophagenzahl (außerhalb der unmittelbaren Laserablationsstelle) zeigte einen Anstieg innerhalb des untersuchten Zeitrahmens (4,00 ± 2,37 Makrophagen vor der Ablation versus 7,00 ± 2,76 Makrophagen bei 4 hpl) (Abbildung 3B). Ebenso nahm die Makrophagenfläche (gemessen inμm 2, 785,8 μm2 ± 723,1μm 2 vor der Ablation gegenüber 1553μm 2 ± 869,9μm 2 bei 4 hpl) zu (Abbildung 3C). Da Makrophagen manchmal schwer zu unterscheiden sind, empfiehlt es sich, die Makrophagenfläche anstelle der Makrophagenzahl zu messen, wie es hier geschehen ist.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> Abbildung 3: Makrophagenrekrutierung bei 4 hpl in 4 dpf Zebrafischlarven. (A) Operkelbereich ohne Ablation und bei 4 hpl. Operkuläre Osteoblasten sind grün markiert, Makrophagen magenta, und der gestrichelte Kreis zeigt den laserablierten Bereich. Maßstabsbalken: 50 μm. (B) Quantifizierung der Anzahl der Makrophagen im Operkelbereich direkt vor (0 hpl) und nach der Ablation (4 hpl). (C) Quantifizierung der Makrophagenfläche (ohne Laserablationsstelle). Gepaarte einseitige t-Tests. Jeder Punkt stellt die Daten einer Larve dar, und es wird der mittlere ± SD angezeigt, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unsere Technik für die gezielte...

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Die hier vorgestellte Methode umfasst die genaue Verletzung des Lebens Zebrafischembryonen mit hochenergetischer Laserpulse und der anschließenden Analyse dieser Verletzungen und deren Wiederherstellung mit der Zeit. Wir zeigen auch, wie genetisch markierten einzelne oder Gruppen von Skelettmuskelzellen kann während und nach der Laser-Licht induzierten Schäden verfolgt werden.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Dieses Video beschreibt die Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Axotomie und der Beobachtung der axonalen Erholung von Verletzungen.

Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung

Quelle: Morsch, M.,  et. al., Auslösen von Zellstress und Zelltod mit konventioneller konfokaler UV-Lasermikroskopie. J. Vis. (2017) In diesem Video untersuchen wir die Technik der hochintensiven UV-Laserablation zur präzisen Ausrichtung und Untersuchung einzelner Neuronen in transgenen Zebrafischen. Wir zeigen, wie man neuronale Reaktionen vorbereitet, immobilisiert und visualisiert, und heben die zelluläre Dynamik von Verletzung und Genesung hervor.

Selektive Einzelneuronen-Laserablation an einer Zebrafischlarve mit einem konfokalen Mikroskop

Quelle: Muto, A., et al. Ablation einer neuronalen Population mit einem Zwei-Photonen-Laser und deren Beurteilung mittels Calcium-Bildgebung und Verhaltensaufzeichnung bei Zebrafischlarven. J. Vis. exp. (2018){{}} In diesem Video,  Es wird ein Zwei-Photonen-Laserablationsverfahren demonstriert, das die selektive Zerstörung von fluoreszierenden Neuronen in Agarose-immobilisierten Zebrafischlarven ermöglicht. Die hochauflösende Bildgebung vor und nach dem Eingriff bestätigt eine effiziente...

Gezielte neuronale Ablation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einer Zebrafisch-Larve

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine genetisch beschrifteten Subpopulation von Neuronen durch einen zwei-Photonen-Laser von Zebrafisch-Larven abtragen.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Die Embryonalentwicklung erfordert eine groß angelegte Koordination der Zellbewegung. Die durch Zwei-Photonen-Anregung vermittelte Laserablation ermöglicht die räumlich kontrollierte 3-dimensionale Ablation großer Gruppen tiefer Zellen. Darüber hinaus kann diese Technik die Reaktion kollektiv wandernder Zellen in vivo auf Störungen in ihrer mechanischen Umgebung untersuchen.

Tiefe und räumlich kontrollierte Volumenablationen mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in der Zebrafisch-Gastrula

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erfassung der Dynamik der Regeneration von Schwanzflossen von Zebrafischlarven auf einer Ganzgewebeskala mit Hilfe von Hellfeld-basierter Stereomikroskopie. Diese Technik ermöglicht es, die Regenerationsdynamik mit einer Einzelzellauflösung zu erfassen. Diese Methodik kann an jedes Stereomikroskop angepasst werden, das mit einer CCD-Kamera und einer Zeitraffer-Software ausgestattet ist.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

Lernen Sie die Zwei-Photonen-Laserablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven kennen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Knochenregeneration und Immunantwort in vivo.

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

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