Name: Ein toxikologischer und ökotoxikologischer Assay auf der Grundlage der Beweglichkeit der Hämozyten von Muscheln (Mytilus galloprovincialis) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Erfahren Sie eine neue in-vitro-Methode zur Bewertung von Toxizität und Ökotoxizität durch Analyse der Hämozyten-Motilität bei Mytilus galloprovincialis. Diese ethischere Alternative zu Wirbeltiertests ermöglicht präzise Umweltmonitorings.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; m Filter (Durchmesser 25 mm)</td><td>ABLUO&nbsp;</td><td></td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>2,5 ml Injektionsspritze 22G</td><td>Strahlen</td><td>2522CM32</td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>96-Well-Polystyrol mit flachem Boden TC-behandelte Mikroplatte</td><td>Corning</td><td>3916</td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>C3881-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Software für chemische Chemotaxis und Migrationswerkzeuge&nbsp;</td><td>(Ibidi GmbH)</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Agilent BioTeck</td><td>Cytation 5</td><td>Geräte: Multimode-Reader für die Zellbildgebung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>472301</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Röhrchen mit konischem Boden</td><td>Corning</td><td>352196</td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>B0394</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Hämozytometer Schnell ablesbar 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>Laborbedarf</td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure)</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chemical ImageJ Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>KBr</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P9881</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk&nbsp;</td><td>104936</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>G7513</td><td>Essentielle Aminosäure für Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O Merk</td><td>(Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Chemisches MgSO4</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M7506</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ausrüstung: Zellbildgebung&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Riedel-de Haen</td><td>31481</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>31434-1KG-R</td><td>Chemie</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fluka</td><td>71519 500g</td><td>Chemie</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chemisch Neutral Rot</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>N4638-1G</td><td>Vitalzellfarbstoff</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P0781-100ML</td><td>Antibiotika für Zellkulturen</td></tr><tr><td>SrCl2&middot; 6H2O Merk</td><td>(Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>255521</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Trypan blau&nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Zell-Farbstoff</td></tr></tbody></table>

ein toxikologischer und ökotoxikologischer assay auf der grundlage der beweglichkeit der hämozyten von muscheln (mytilus galloprovincialis)

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

Die Studie stellt eine neuartige in vitro-Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vor, wobei die Motilität von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten genutzt wird. Abbildung 1A-C zeigt eine repräsentative Zeitraffer-Bildgebung von Hämozyten nach 30-minütiger Anheftung an den Boden der Vertiefung. Die Zellen in der Abbildung wurden kurz vor der Motilitätsbeurteilung mit Neutralrot gefärbt. Die Zellbewegungen wurden mit Hilfe der optischen Mikroskopie mit einer Rate von einem Bild pro Minute für 10 Minuten bei 20-facher Vergrößerung mit einem Multimode-Lesegerät überwacht. Abbildung 1A-C zeigt drei der 11 Frames, die aus demselben Region of Interest (ROI) bei 0 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten aufgenommen wurden. In allen drei Figuren sind dieselben Zellen nummeriert, um ihre Bewegung hervorzuheben, und die Nummerierung bleibt in allen Figuren konsistent, um ihre Flugbahnen deutlich zu veranschaulichen.
Die Zellen zeigen einzellige Bewegungen, die auf der Aktivität der Lamellipodien und schnellen Formveränderungen basieren. Die Zellen wurden mit dem lebenswichtigen Farbstoff Neutralrot markiert, um ihre Sichtbarkeit während des Trackings zu verbessern. Neutralrot ist ein amphiphiler und schwach kationischer Farbstoff, der die Zellmembran leicht durchdringen kann. Sobald sich der Farbstoff in den Zellen befindet, wird er durch die Protonierung in den Lysosomen eingeschlossen. Muschelhämozyten, insbesondere Granulozyten, weisen ein gut entwickeltes lysosomales System auf; Daher sind sie durch Neutralrot-Färbung gut sichtbar, wobei das Zytoplasma reich an mehreren rot markierten Lysosomen ist und der Zellkern (nicht durch den Farbstoff markiert) als durchscheinendes Loch erscheint.
Durch die Anwendung des Protokolls können nach Udayan et al.23 zwei Haupt-Hämozyten-Morphotypen beobachtet werden: (1) Spreizzellen mit einer bipolaren Bohnenform und manchmal einem amöboiden Umriss und kleinere runde sternförmige Zellen (Zellen n = 3 und 10). In beiden Zelltypen war die Bewegung durch kontinuierliche Formveränderungen gekennzeichnet, mit kontinuierlicher Ausdehnung und Zurückziehung von Pseudopodien und Filopodien.
Die Protokollanwendung ermöglicht die erfolgreiche Beurteilung der Hämozytenmotilität durch die Erstellung von Trajektoriendiagrammen, wie in Abbildung 2 dargestellt, und die Berechnung der wichtigsten velocimetrischen Parameter wie mittlere Geschwindigkeit und Direktheit. Diese entsprachen jeweils 6,46 ± 0,2 μm/min und 0,56 ± 0,02 (mittlere ± SEM) für Spreizzellen und 5,18 ± 0,34 μm/min bzw. 0,37 ± 0,03 für kleine Zellen unter basalen physiologischen Bedingungen nach 30 min Anheftung an den Boden der Vertiefung. Daher ermöglicht das Protokoll die Klassifizierung verschiedener Hämozytenpopulationen auf der Grundlage velozimetrischer Parameter.
Durch die Anwendung des Protokolls können Veränderungen des velozimetrischen Parameters der Hämozytenmotilität nach Exposition gegenüber Arzneimitteln oder Schadstoffen festgestellt werden. Abbildung 3A-D zeigt repräsentative Ergebnisse der In-vitro-Exposition von Muschel-Hämozyten gegenüber Paracetamol, einem der Arzneimittel, das in die Umwelt (PiE) mit der höchsten Konzentration und den höchsten Nachweishäufigkeiten in Flüssen auf der ganzen Welt freigesetzt wird31.
Laut Udayan et al.23 wurde in Kontrollzellen in beiden Zellmorphotypen ein signifikanter Anstieg der Geschwindigkeit mit der Zeit beobachtet, was auf eine Aktivierung der Hämozyten während der 24-Stunden-Kultur hindeutet, was vermutlich an die Entzündungsreaktion erinnert, die experimentell durch Entzug und Plattierung in der Kulturumgebung induziert wurde. Wenn die Zellen dem Arzneimittel ausgesetzt wurden, war die Motilitätsaktivierung der Hämozyten in Spreizzellen (Abbildung 3A) nach 24 h signifikant reduziert, nicht jedoch in kleinen runden Zellen (Abbildung 3C), die durch eine niedrigere mittlere Basalgeschwindigkeit gekennzeichnet waren (wie zum Zeitpunkt 0 bewertet). Darüber hinaus ermöglichte das Protokoll den Nachweis von Veränderungen der Zelltrajektorie nach Arzneimittelexposition, wie die signifikante Zunahme der Direktheit kleiner Zellen nach 24 Stunden und die Abnahme der Direktheit nach 1 Stunde Exposition in gespreizten Zellen zeigt (Abbildung 3C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Repräsentative Zeitrafferbildgebung von neutralrot gefärbten Hämozyten nach 30 min Anheftung an den Boden der Vertiefung. Die Zellen wurden kurz vor der Motilitätsbeurteilung mit dem Vitalfarbstoff Neutral Red gefärbt. Die Zellbewegungen wurden mit Hilfe der optischen Mikroskopie mit einer Rate von einem Bild pro Minute für 10 Minuten bei 20-facher Vergrößerung überwacht. Der Kürze halber werden in den Bereichen A, B und C drei der 11 Frames angezeigt, die aus demselben Interessenbereich (ROI) bei 0 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten erfasst wurden. In allen drei Ziffern sind dieselben Zellen nummeriert, um ihre Bewegung zu veranschaulichen, und Pfeile zeigen die Zeitintervalle an. Maßstabsleisten stellen 100 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Repräsentatives Trajektoriendiagramm von M. galloprovincialis-Hämozyten . Die gezeigten Trajektorien stammen aus einem einzigen Bohrloch. Die Trajektorien von 25 Zellen sind dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig03v2.jpg"> 
Abbildung 3: Einfluss der Paracetamol-Exposition (24 h) auf die Geschwindigkeit und Direktheit von Spreizzellen (A,B) und kleinen runden sternförmigen Zellen (C,D). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Signifikanz der Daten wurde durch eine unidirektionale ANOVA und den Tukey-Post-Test bewertet. *p &lt; 0,05 vs. Kontrolle (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig03largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Ein toxikologischer und ökotoxikologischer Assay auf der Grundlage der Beweglichkeit der Hämozyten von Muscheln (Mytilus galloprovincialis)

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate ...

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