Name: Einstufige Extraktion und zymographische Analyse von bakteriellen Gelatinasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Erfahren Sie eine vereinfachte Methode zur Extraktion und zymographischen Analyse aktiver Gelatinasen aus Leptospira. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung von Membranproteinen für die Pathogeneseforschung.

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<ol><li>Yue, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Biology of the extracellular matrix.</a> J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).</li>
<li>Cabral-Pacheco, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).</li>
<li>Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60K+gelatinase+involved+in+mammary+gland+involution+is+regulated+by+%CE%B2-oestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol.</a> Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).</li>
<li>Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+structures%2C+and+collagen-degrading+mechanisms+of+bacterial+collagenolytic+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+46+kDa+gelatinase+on+the+outer+membrane+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).</li>
<li>Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+folding%2C+purification+and+characterization+of+Escherichia+coli+outer+membrane+protease+OmpT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT.</a> Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+membrane+environments+regulate+enzymatic+behaviors+of+Salmonella+outer+membrane+protease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Bio+Med+Chem+Au%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease.</a> ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).</li>
<li>Sarma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+proteome+analysis+shows+the+abundance+of+histidine+kinase+sensor+protein%2C+DNA+helicase%2C+putative+lipoprotein+containing+peptidase+M75+domain+and+peptidase+C39+domain+protein+in+Leptospira+interrogans+grown+in+EMJH+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium.</a> Pathogens. 10 (7), 852(2021).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+solubilization+and+reconstitution+by+detergents.+Symmetrical+analysis+of+the+two+processes+using+octaethylene+glycol+mono-n-dodecyl+ether%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether.</a> Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).</li>
<li>Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+solubilization+of+lipid+bilayers%3A+a+balance+of+driving+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces.</a> Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Zeug, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+microscopic+methods+for+the+neural+ECM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Current microscopic methods for the neural ECM analysis.</a> Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zymography+analysis+of+proteinase+activity+present+in+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>6-Aminocapronsäure</td><td>Merck</td><td>Nr. A2504</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 695092</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 32201</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. A-3553</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. A-3678</td><td></td></tr><tr><td>Bis Acrylamid</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. M7279</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. A-8022</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blau</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. B-8026</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>Nr. C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brillantblau</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>Desoxycholat</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>Nr. D6750</td><td></td></tr><tr><td>Ellinghausen&ndash; McCullough&ndash; Johnson&ndash; Harris (EMJH) medium, Difco</td><td>&nbsp; Difco</td><td>&nbsp; 279410</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Merck</td><td>Nr. G9382</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Merck</td><td>Nr. G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycin G8790</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Leptospira interrogans Serovar Copenhageni Stamm Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198)&nbsp;, gepflegt im Biorepository des ICMR-RMRC Portblair</td><td>Gepflegt im Biorepository des ICMR-RMRC Port Blair</td><td></td><td>Optimale Wachstumstemperatur 30 & Grad; C</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid M8266</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 17995-7</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>P4417&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Werkzeug zum Trennen von Platten</td><td>Wunder Wedgle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>FIBERLite F15 8x50 Zylinder</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. L-4396</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; T-9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>Nr. T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Basis (TRIS)&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Nr. T6066</td><td></td></tr></tbody></table>

einstufige extraktion und zymographische analyse von bakteriellen gelatinasen

One-step Extraction and Zymographic Analysis of Bacterial Gelatinases

Das Ergebnis zeigt das Zymogramm des leptospiralen Proteins und der Gelatinasen aus humanem Serum. Die Ergebnisse, die in Abbildung 1 gezeigt sind, stellen Proteasen als weiße, klare Banden auf blauem Hintergrund dar. Die Banden stellen Bereiche dar, in denen die copolymerisierte Gelatine abgebaut und daher nicht gefärbt ist, während andere Bereiche des gesamten Gels aufgrund des Vorhandenseins von Gelatine blau gefärbt sind. Des Weiteren zeigt sich, dass, obwohl Gelatine auch ein Protein is...

Einstufige Extraktion und zymographische Analyse von bakteriellen Gelatinasen

Proteinases of pathogenic bacteria contribute to invasion and pathogenesis by actively degrading the host's extracellular matrix (ECM) components and ...

one-step-extraction-and-zymographic-analysis-of-bacterial-gelatinases

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt eine activity-based-Assay zum Nachweis Matrixmetalloproteinasen in Kulturüberständen oder Körperflüssigkeiten.

Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie

Eine geradlinige Reihe von Methoden zur Isolierung und Bestimmung der Identität der am häufigsten vorkommenden Proteine ​​in der Skelettmuskulatur exprimiert. Etwa 800 Plätze sind auf einem zweidimensionalen Gel aus 10 mg Muskel zu erkennen, dies ermöglicht die Bestimmung des Geschlechts-spezifische Protein-Expression. Diese Methoden werden gleichwertige Ergebnisse in den meisten Geweben.

Skeletal Muscle Gender Dimorphismus von Proteomics

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Wir beschreiben die prototypische Verfahren zur Herstellung Mikroskop Deckgläser mit fluoreszierenden Gelatine zur Visualisierung invadopodia-vermittelte Matrixabbau beschichtet. Rechenverfahren Verwendung verfügbarer Software für die Quantifizierung der resultierenden Ebenen der Matrix Proteolyse durch einzelne Zellen innerhalb einer Mischpopulation und für Gruppen, die vielzelligen gesamte mikroskopische Felder dargestellt.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

In diesem Video führen wir Zymographie durch, eine elektrophoretische Technik, um die proteolytische Aktivität in biologischen Proben zu analysieren.

Fluoreszierende Peptid-Zymographie: Eine modifizierte Technik zum Nachweis der Proteaseaktivität unter Verwendung fluorogener Substrate in Zymogramm-Gelen

Dieses Video demonstriert die Zymographie-Gelelektrophorese-Technik zur Beurteilung der Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die in Zellkulturüberständen vorhanden sind. Die aktiven MMPs bauen das MMP-spezifische Substrat ab, das in ein Polyacrylamidgel eingebettet ist, das nach der Färbung als klare Banden auf einem dunklen gefärbten Hintergrund erscheint.

Zymographie-Gelelektrophorese: Eine elektrophoretische Technik zum Nachweis von Matrix-Metalloproteinasen durch Bewertung der enzymatischen Aktivität

Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Trehalose-Analoga entwickeln sich zu wichtigen Molekülen für bio(techno)logische und biomedizinische Anwendungen. Wir beschreiben ein optimiertes Protokoll zur enzymatischen Synthese und Reinigung von Trehalose-Analoga, das einfach, effizient, schnell und umweltfreundlich ist. Die Anwendung auf die schnelle Herstellung und Verabreichung einer Sonde zum Nachweis von Mykobakterien wird demonstriert.

Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Die Proteinzusammensetzung des menschlichen Mitralklappens ist noch teilweise unbekannt, weil seine Analyse durch niedrige Zellularität und damit durch eine geringe Proteinbiosynthese kompliziert wird. Diese Arbeit liefert ein Protokoll zur effizienten Extraktion von Protein für die Analyse des Mitralklappenproteoms.

Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Erfahren Sie eine vereinfachte Methode zur Extraktion und zymographischen Analyse aktiver Gelatinasen aus Leptospira. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung von Membranproteinen für die Pathogeneseforschung.

Einstufige Extraktion und zymographische Analyse von bakteriellen Gelatinasen

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