Name: CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Erfahren Sie CRISPR-vermittelte Gendeletion in humanen embryonalen Stammzellen mittels lentiviraler Transduktion. Diese Methode ermöglicht stabile Knockouts ohne Beeinträchtigung der Pluripotenz und Differenzierungsfähigkeit.

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<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38,5 ml, steril + zertifiziert frei Open-Top dünnwandige, ultraklare Röhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Rekombinantes humanes</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abklonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basalmembranmatrix, LDEV-frei</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamin</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Medien</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DGEM-NÄHRSTOFFMISCHUNG F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca und Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Kaninchen-mAb-Antikörper</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für sanfte Zelldissoziation</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) 100x Lösung</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Kaninchen-mAb</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut-Serumersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMINE, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH Polyklonaler Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 complete</td><td>media Stammzelltechnologien</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog Antikörper</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Supplement 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Supplement 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Antikörper</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybren-Infektionsreagenz</td><td>Sigma</td><td>TR1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, verzweigt</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Lentivirus Titer Kit</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Rock-Inhibitor Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 Antikörper</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Wizard Genomisches DNA-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9-vermittelte gendeletion in humanen pluripotenten stammzellen, die unter feederfreien bedingungen kultiviert wurden

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

Klonierung von L2HGDH sgRNAs in lentiCRISPRv2 puro Der lentiCRISPRv2 puro-Vektor wurde kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und mit BsmB1 verdaut, was zur Freisetzung eines 1,8 Kb großen Stufferfragments führte. Wie in Abbildung 2A gezeigt, wurde ein vollständiger Aufschluss des Vektors beobachtet. Für jedes Konstrukt wurden sechs Klone auf das Vorhandensein oder Fehlen von Inserts untersucht, wobei eine reverse sgRNA-Sequenz als Primer und ein forward-Primer (U6-459F) aus der Vektorsequenz verwendet wurden. Bei diesem Ansatz ergaben nur die Klone mit dem Insert ein PCR-Produkt von 288 bp, und negative Klone, die nicht die umgekehrte Sequenz von sgRNA enthielten, führten zu keinem PCR-Produkt, wie in Abbildung 2B gezeigt.
H9-Infektionen, stabile Selektionen und Western Blot hES-Zellen wurden mit lentiviralen Partikeln infiziert, die zwei verschiedene sgRNAs exprimierten, die auf das Exon 1 des L2HGDH-Gens abzielen, und mit Puromycin selektiert. Die Western-Blot-Analyse wurde an heterogenen Populationen von stabil co-exprimierenden sgRNA- und Cas9-Zellen durchgeführt, um festzustellen, welche der beiden verwendeten sgRNAs bei der Induktion der Gendeletion effizienter war. Wie in Abbildung 3A gezeigt, war L2HGDH-sgRNA-1 effizienter als die andere Sequenz bei der Verringerung der Expression von L2HGDH in heterogenen Zellpopulationen.
Klonale Selektion, Expansion und Proteinanalyse Einzelzellselektion und klonale Expansion wurden für Zellen durchgeführt, die L2HGDH-sgRNA-1 exprimieren. Die Vertiefungen, die einzelne Klone lieferten, wurden markiert und gezüchtet, bis eine ausreichende Größe erreicht war, damit die Kolonien (in der Regel 2 Wochen) weiter expandieren, kryokonservieren und analysieren konnten (Abbildung 3B). Insgesamt wurden 22 Klone mittels Western-Blot-Analyse analysiert, die fünf homozygote Knockouts (23%) für L2HGDH ergab. Dieses Ergebnis zeigt eine hohe Effizienz des Gen-Knockouts unter Verwendung von lentiviralem Gentransfer für eine stabile Co-Expression von sgRNA und Cas9 aus einer einzigen Kassette. Abbildung 4 zeigt eine Western-Blot-Analyse der fünf homozygoten Knockout-Klone zusammen mit Kontrollzellen, die eine um 100% reduzierte Expression im Vergleich zur Kontrolle in den ausgewählten Klonen zeigt.
Analyse auf DNA-Ebene Um die CRISPR-Mutationsstelle stromaufwärts der PAM-Erkennungssequenz von Cas9 zu kartieren, wurde die Mutation Sites Based Specific Primers Polymerase Chain Reaction (MS-BSP PCR) unter Verwendung genomischer DNA von Kontrollzellen und von fünf verschiedenen Klonen durchgeführt. Wie in Abbildung 5 gezeigt, weisen zwei Klone (A5 und B4) Mutationen in unmittelbarer Nähe der PAM-Erkennungssequenz auf, während die anderen drei Klone (A1, A9 und B12) zeigten, dass die Mutation möglicherweise nicht sehr nahe an der PAM-Stelle liegt und weiter stromaufwärts der 20bp-sgRNA-Sequenz innerhalb des Exons 1 des L2HGDH-Gens liegt.
Um die genauen Mutationen in der DNA zu finden, wurden gereinigte PCR-Produkte aus Kontrollzellen (Vektor infizierte nur H9) sowie drei verschiedene CRISPR-Klone, A5, A1 und B4, einer Sanger-Sequenzierung unterzogen und Mutationsstellen mit dem Multiple-Alignments-Tool clustalw stromaufwärts der PAM-Stelle8 kartiert. Die Ergebnisse zeigten eine Deletionsmutation im A5-Klon stromaufwärts der PAM-Stelle. Die beiden anderen Klone, A1 und B4, zeigten eine Insertionsmutation stromaufwärts der PAM-Stelle, wie in Abbildung 6 dargestellt.
Funktionale Analyse von Klonen Nach der Generierung von CRISPR-Knockout-Zelllinien in hES-Zellen besteht der nächste Schritt darin, deren Pluripotenz und Differenzierungspotenzial zu bestätigen. Zu diesem Zweck testeten wir verschiedene Pluripotenzmarker für drei verschiedene Klone, A1, A5 und B4, und verglichen die Ergebnisse mit Kontrollzellen (nur vektorinfizierte H9-Zellen). Die Ergebnisse zeigten keine Veränderung des Pluripotenzpotenzials von Knockout-Zelllinien, das durch Immunfärbung für OCT4-, NANOG- und SOX2-Marker bestimmt wurde. Als nächstes wurden die Kontroll- und Knockout-Zelllinien auch für den Zellproliferationsmarker KI67 gefärbt, der ebenfalls keine Veränderung der Knockout-Zelllinien im Vergleich zur Kontrolle zeigte. Diese Ergebnisse zeigen, dass der CRISPR-Knockout die Selbsterneuerungseigenschaften dieser Zellen nicht beeinflusste. Darüber hinaus wurden auch die EB- und Koloniebildung nicht beeinflusst (Abbildung 7). Mit Hilfe von in vitro Methoden, die in unserem Labor etabliert wurden, wurden alle Klone erfolgreich in drei Keimblattzellen differenziert, was durch Immunfärbung für PAX6 (Neuroektodermmarker), Brachyury (Mesodermmarker) und FOXA2 (Endodermmarker) bestätigt wurde. Es wurde keine Veränderung des Differenzierungspotenzials von Knockout-Zelllinien im Vergleich zu Kontrollzellen beobachtet, was zeigte, dass die Knockout-Zellen ihr Differenzierungspotenzial beibehielten (Abbildung 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Studiendesigns in 5 Schritten. Schritt 1: Design und Klonierung von sgRNAs in einen Bsmb1-verdauten V2-CRISPR-Vektor. Schritt 2: Erzeugung von lentiviralen Partikeln unter Verwendung von Eintrittsvektoren, die sgRNA tragen, zusammen mit Verpackungsplasmiden durch Co-Transfektion HEK293T Zellen mittels Polyfektionen und Viruskonzentration mittels Ultrazentrifugation. Schritt 3: Infektion von hES-Zellen mit lentiviralen Partikeln bei einem MOI von 10-20 und stabile Zellselektion mit Puromycin, gefolgt von der Analyse heterogener Zellpopulationen, um die Effizienz von sgRNAs zu sehen. Schritt 4: Klonierung einzelner Zellen durch Begrenzung der Verdünnungsmethode aus den Zellen, die in heterogenen Populationen den maximalen Knockdown zeigten, und Selektion einzelner Klone. Schritt 5: Erweiterung einzelner Klone und Analyse auf DNA-Ebene, Protein- und Funktionsanalyse von Klonen auf Stamm- und Differenzierungspotenzial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Klonierung von sgRNAs im lentiCRISPR V2.puro-Vektor. (A) Verdau des lentiCRISPR V2.puro-Vektors mit dem Restriktionsenzym BsmB1. Der Pfeil zeigt ein 1,8 KB großes Stufferfragment, das beim Aufschluss des Vektors freigesetzt wird. (B) Kolonie-PCR-Analyse für verschiedene Klone der L2HGDH sgRNA-Konstrukte 1 und 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Western Blots und klonale Vermehrung mittels Einzelzellselektion. (A) Western-Blot-Analyse von zwei verschiedenen biologischen Replikaten (S1 und S2) heterogener Populationen von stabil co-exprimierender sgRNA (L2H-1 und L2H-2) und Cas9 zusammen mit Kontroll-(C) H9-hES-Zellen. (B) Einzelzellselektion und klonale Expansion von H9-Zellen, die L2HGDH-sgRNA-1 stabil exprimieren. Pfeile zeigen Vertiefungen mit 96-Well-Platten an, die nur einzelne Klone zeigen. Maßstabsleiste = 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Western-Blot-Analyse von verschiedenen Klonen von H9. (A-C) Die Western-Blot-Analyse von Gesamtzelllysaten von 22 Klonen ergab fünf homozygote Knockouts (23%) für L2HGDH. (D) Bestätigung von L2HGDH-Knockouts aus einem anderen biologischen Replikatexperiment mittels Western Blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
Abbildung 5: MSBSP PCR-Analyse verschiedener H9-Klone. (A) Sequenzanalyse des L2HGDH-Exons 1, das für die MSBSP-PCR-Analyse verwendet wird. (B) Optimierung der Annealing-Temperatur für die MSBSP PCR-Analyse mittels Kontrolle und H9 V2 L2HGDH KO Klon B4. Bei 96,8 zeigt das Steuerelement ein Band an, aber B4 zeigt kein Band an, wie durch Pfeile dargestellt. (C) Die Analyse aller homozygoten KO-Klone führte zu der folgenden Kartierung der Mutationsstelle innerhalb von Exon 1. A1 = In/Del nicht in der Nähe des PAM-Standorts; A5 = In/Del In der Nähe des PAM-Standorts; A9 = In/Del Ziemlich nah am PAM-Standort; B4 = In/Del Sehr nah am PAM-Standort B12 = In/Del nicht in der Nähe des PAM-Standorts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
Abbildung 6: Ausrichtung von Sanger-sequenzierten PCR-Produkten mit der Referenzsequenz des L2HGDH-Exons 1. Mehrere Alignments von Sanger-sequenzierten PCR-Produkten aus A1, A5 und B4 und Kontrollzellen wurden zusammen mit einer Referenzsequenz innerhalb des ersten Exons von L2HGDH aus der NCBI-Datenbank durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
Abbildung 7: Funktionelle Charakterisierung von CRISPR-Knockout-Zelllinien. (A) Die Zellen wurden im Vergleich zu den kontrollierten H9-hES-Zellen auf Pluripotenzmarker (OCT4, NANOG, SOX2), Selbsterneuerung (KI67), EBs und Koloniebildung immungefärbt. Maßstab: 100 μM. (B) Der Prozentsatz der positiv (+ve) exprimierenden Zellen wurde relativ zur DAPI-Färbung berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
Abbildung 8: Differenzierungspotenzial von CRISPR-Knockout-Zelllinien. Funktionelle Charakterisierung von CRISPR-Knockout-Zelllinien hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials anhand von Markern für PAX6 (Neuroektoderm), Brachyury (Mesoderm) und FOXA2 (Endoderm) in Bezug auf die kontrollinfizierten H9-Zellen. Maßstabsbalken: 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schritt des Protokolls</td>
			<td>Zeitaufwand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klonierung von sgRNAs in LentiCRISPRv2</td>
			<td>4 Tage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus-Produktion und Titerbestimmung</td>
			<td>5 Tage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hES-Infektionen, stabile Zellselektion und Expansion</td>
			<td>2 Wochen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klonale Selektion und Expansion einzelner Zellen</td>
			<td>2 Wochen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Funktionale Analyse von Klonen</td>
			<td>2 Wochen</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Zeitplan für die Protokollschritte und geschätzter Zeitaufwand.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

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Forschung

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Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Genom-Editierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) kann schnell und effizient durchgeführt werden. Hier wird ein robustes experimentelles Verfahren zur genetischen Veränderung von hPSCs vorgestellt, wie es am Beispiel der Editierung des AAVS1-Safe-Harbor-Locus zur Expression von EGFP und zur Einführung von Antibiotikaresistenzen veranschaulicht wird.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Protokolle HPSC Mutantenlinien mit der iCRISPR Plattform und zu differenzieren hPSCs in Glukose-responsive β-ähnlichen Zellen beschrieben zu erzeugen. Genom Bearbeitungstechnologie mit HPSC gerichtete Differenzierung Die Kombination bietet eine leistungsfähige Plattform für die systematische Analyse der Rolle von Lineage Determinanten in der menschlichen Entwicklung und Progression der Erkrankung.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Das folgende Protokoll enthält Anweisungen für die Anpassung menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu Feeder-freien Kultur mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (KSR-FF). Einmal angepasst, Anweisungen für die kontinuierliche Wartung sind ebenfalls vorhanden.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Erfahren Sie CRISPR-vermittelte Gendeletion in humanen embryonalen Stammzellen mittels lentiviraler Transduktion. Diese Methode ermöglicht stabile Knockouts ohne Beeinträchtigung der Pluripotenz und Differenzierungsfähigkeit.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

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