Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

[Dozent] Bereiten Sie zunächst Agros mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 3 % im Embryomedium vor und erhitzen Sie das Agros auf eine Temperatur, die für die Manipulation von Zebrafischen sicher ist, ohne Schäden zu verursachen. Bevor das Agros abkühlt und sich verfestigt, legen Sie die Larven, die zwei bis sieben Tage nach der Befruchtung mit der Rückenseite nach oben sind, in eine Petrischale mit Glasboden. Sobald der Agros mit den Larven an Ort und Stelle erstarrt ist, geben Sie fünf Milliliter Embryomedium in die Schale. Schneiden Sie den Agros mit einem Skalpell nach Bedarf um die Larven herum. Übertragen Sie die Petrischale mit dem Zebrafisch auf den Tisch des Konfokalmikroskops. Nachdem Sie sich 20 Minuten lang akklimatisiert haben, verwenden Sie Hellfeld-Bildgebung, um den Fisch unter dem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv bei Raumtemperatur zu zentrieren. Stellen Sie die Aufnahmeparameter des konfokalen Mikroskops basierend auf den Qualitäten und Expressionsniveaus des fluoreszierenden Moleküls sowie der Tiefe und den optischen Eigenschaften des Gewebes ein. Passen Sie die Laserleistung und die Master-Gain-Einstellungen an, um das Fluoreszenzlicht richtig im optimalen Bereich einzufangen und unnötige Verluste der erfolgsabhängigen Fluoreszenz des G-Camps zu verhindern. Zentrieren Sie dann das Sichtfeld auf einen neuronalen Cluster, der sich im rostralen Teil des Rückenmarks befindet. Führen Sie einen Zeitreihenscan mit einem Sichtfeld von 79,86 Quadratmikrometern bei einer Bildrate von 1,20 Bildern pro Sekunde und einer räumlichen Auflösung von 0,119 Quadratmikrometern pro Pixel durch. Passen Sie das Sichtfeld, die Größe und die Erfassungsgeschwindigkeit basierend auf den Zielen des Experiments an. Zwei Minuten nach Beginn der Bildgebung geben Sie 41,67 Mikroliter entweder Aloe-Isothiocyanat-Stammlösung oder Embryomedium in die Schale und setzen Sie die Aufzeichnung etwa 30 Sekunden lang fort, um Veränderungen in der Aktivität von G Camp 6 in der interessierenden Region durch Zeitrafferbildgebung zu beobachten. Wenn die aufgezeichnete Ausgabe nicht im Dot-TIF-Dateiformat vorliegt, exportieren Sie die Bilddateien als Dot-TIF-Dateien aus der Mikroskop-Software-Suite für die nachgelagerte Fidschi-Analyse. Nachdem Sie die Fiji-Software für die Analyse neuronaler Spuren heruntergeladen haben, öffnen Sie Fiji und importieren Sie die Punkt-CZI-Dateien in das Programm. Verwenden Sie die Kreis- oder Freihandwerkzeuge in Fidschi, um einen Bereich oder ein Neuron von Interesse hervorzuheben, indem Sie auf die entsprechenden Symbole klicken. Nachdem Sie die gewünschte Region oder den ROI ausgewählt haben, klicken Sie in der Symbolleiste "Fidschi" auf "Analysieren", "Werkzeuge" und "ROI-Manager". Klicken Sie auf T hinzufügen, um den ausgewählten ROI zum ROI-Manager-Fenster hinzuzufügen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Mehr und Multi-Measure, um den ROI zu analysieren. Behalten Sie die Standardeinstellungen bei und klicken Sie auf OK, um Rohdaten zu generieren. Speichern Sie dann die Ausgabe als CSV-Datei zur weiteren Bearbeitung mit Python oder Tabellenkalkulationen. Normalisieren Sie nun die Rohdaten, um sie als neuronale Spur darzustellen, indem Sie die letzten 30 Sekunden des zweiminütigen Prästimulus mitteln, eine normalisierte Fluoreszenzintensität mit der angegebenen Formel erzeugen und die normalisierten Daten als neuronale Spuren darstellen. Die Verabreichung von Aloe-Isothiocyanat führte zu einem Anstieg der G CAMP 6S-Fluoreszenz in einer lokalisierten Gehirnregion von Zebrafischlarven, was auf eine erhöhte neuronale Aktivität hinweist. Bei einer langsamen Aufnahmegeschwindigkeit von 0,10 Bildern pro Sekunde waren Neuronen im Hinterhirn und Rückenmark mit hoher Auflösung deutlich sichtbar. Die Erhöhung der Aufnahmegeschwindigkeit auf 0,79 Bilder pro Sekunde führte zu einem leichten Verlust der räumlichen Auflösung, aber zu einer verbesserten zeitlichen Auflösung. Bei 3,16 Bildern pro Sekunde erschienen die Neuronen weniger deutlich, während sie mehr zeitliche Dynamik erfassten.