Name: Kostengünstige Mikrofluidik-Designs für die Laminierung von Polyethylenterephthalat für die Multiplex-Bildgebung von Zebrafischen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Erfahren Sie kostengünstige Mikrofluidik-Fertigung mit PET-Laminierung für hochauflösende Multiplex-Bildgebung lebender Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht schnellere Iteration und verbesserte räumliche Auflösung gegenüber herkömmlichen PDMS-Geräten.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Rundes Deckglas mit 25 mm Durchmesser #1 Dicke</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1760-025</td><td>Montagematerial für den Sockel. Die Dicke wurde auf der Grundlage der Spezifikationen der Mikroskoplinse gewählt.</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator v28.5</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Vektoreditor zum Entwerfen des Gerätemusters.</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>Zur Herstellung von E3 medium.</td></tr><tr><td>Design-PNG-Dateien (Online-Spiegel)</td><td>N/A</td><td>N/A</td> https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png<<td>br/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png</td></tr><tr><td>Design Space for Desktop v8.39</td><td>Cricut</td><td>N/A</td><td>Proprietäre Software zum Steuern des Bastelschneiders.</td></tr><tr><td>Fusion Plus 7000L</td><td>GBC</td><td>1703098</td><td>Thermo-Laminiergerät. Dieses spezielle Modell wurde aufgrund von Merkmalen der Lebensqualität ausgewählt, wie z. B. der maximalen Blechstapelgröße.</td></tr><tr><td>German Carbide Premium Klinge</td><td>Cricut</td><td>10396595</td><td>Ersatzklinge für Bastelschneider.</td></tr><tr><td>Grau Basic Tool</td><td>Set Cricut</td><td>10307854</td><td>Werkzeugset zum Jäten von Schnitten, Reinigen von Matten und Montieren von PET-Platten. Optional.&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Acros Organisches</td><td>223211000</td><td>Zur Herstellung von E3-Medium.</td></tr><tr><td>Maker 3</td><td>Cricut</td><td>10669040</td><td>Craft Cutter. Die Cricut Maker 3 wurde der Silhouette Cameo 4 aus Gründen der Software-Benutzerfreundlichkeit vorgezogen, aber jeder Bastelschneider, der Schwarz-Weiß-Bilder lesen kann, funktioniert.</td></tr><tr><td>MemGlow 560</td><td>Zytoskelett</td><td>MG02-10</td><td>Roter Lebendzellfarbstoff für Zellmembranen. Kein Waschen erforderlich. Verwendet in Abbildung 3.</td></tr><tr><td>Nr. 22 Carbon Skalpellklinge</td><td>Surgical Design</td><td> 22-079-697</td><td>Skalpellklinge für manuelle Schnitteinstellungen. Jedes ähnliche Bastelmesser (z. B. X-acto #2 Messer) funktioniert ebenfalls.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Zur Herstellung von E3 medium.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Zur Herstellung von E3 mittel.</td></tr><tr><td>StandardGrip Selbstklebende Schneidematte</td><td>Cricut</td><td>10138842</td><td>Montagematte für Bastelschneider. Die LightGrip-Schneidematte funktioniert auch, aber vermeiden Sie die StrongGrip- und FabricGrip-Schneidematten, da die Stärke des Klebstoffs den endgültigen Schnitt beim Jäten und Entfernen verziehen kann. Klebstoff auf Matten nutzt sich bei fortgesetztem Gebrauch ab; Tauschen Sie die Matten nach Bedarf aus.</td></tr><tr><td>Schreibwarenband 12 mm</td><td>Deli</td><td>30014</td><td>Büroklebeband. Die Marke Deli wurde durch Tests ausgewählt, um die Entfernung nach dem Laminieren zu gewährleisten.</td></tr><tr><td>Sekundenkleber, flüssiger</td><td>Loctite</td>- <td>1364076</td><td>Cyanacrylat-Kleber. <stark>Der verwendete Kleber muss flüssig sein</stark> Gelformulierungen dichten die Gerätekanten nicht ausreichend ab oder machen sie nicht wasserdicht.</td></tr><tr><td>PET-Thermolaminierbeutel, 3 mil</td><td>Scotch</td><td>TP3854</td><td>PET-Platten mit Wärmekleber. Die Blätter werden als Sandwichpaare geliefert und sollten vor der Verwendung getrennt werden. Schneiden Sie mit der Klebeseite nach unten.</td></tr><tr><td>PET-Thermolaminierbeutel, 5 mil</td><td>Scotch</td><td>TP5854</td><td>PET-Platten mit Wärmekleber. Die Blätter werden als Sandwichpaare geliefert und sollten vor der Verwendung getrennt werden. Schneiden Sie mit der Klebeseite nach unten.</td></tr><tr><td>Tricain (MS-222)</td><td>Syndel</td><td>IC10310680</td><td>Fischanästhetikum.</td></tr></tbody></table>

kostengünstige mikrofluidik-designs für die laminierung von polyethylenterephthalat für die multiplex-bildgebung von zebrafischen

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Zum Vergleich der Bildqualität, die durch ein konfokales Laserscanning mit und ohne Hilfe des RADISH erzeugt wurde, wurden Embryonen, die den intensitätometrischen Calcium-Biosensor GCaMP6f22,24 in der äußeren Epithelschicht exprimieren, mit MemGlow 560 gefärbt und mit einem inversen konfokalen Laserscanning, das die gesamte Dicke der Schwanzflossenfalte abdeckte, in einem Zeitintervall von 1 min pro Bild abgebildet (Video 2). Ohne das Gerät (Abbildung 3A) drifteten die Proben erheblich und wiesen Streifenartefakte auf, die sich aus der Begrenzung des Z-Stapels auf 25 Schichten ergaben, um im Vergleich zur Bildgebung mit dem Gerät innerhalb der angegebenen zeitlichen Auflösung zu passen (Abbildung 3B). Das RADISH wurde weiterhin verwendet, um Calciumtransienten unmittelbar nach der Verwundung in Embryonen zu untersuchen, die Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821 exprimieren, wobei endogenes E-Cadherin in rot und zytoplasmatisches Calcium im apikalen Epithel grün hervorgehoben wurde. Die Embryonen wurden parallel zu den Seiten der zentralen Kammer mit einer Skalpellklinge (Abbildung 4A und Video 3) oder durch direkte Laserablation mit einem IR-Laser (Abbildung 4B) verwunden und dann durch die gesamte Dicke der Schwanzflossenfalte abgebildet. 
Um die Wirksamkeit des RADISH für die längerfristige Bildgebung zu demonstrieren, untersuchten wir die Rekrutierung von Immunzellen an den Wundrand für 24 Stunden nach der Wunde. Vier Zebrafischembryonen mit 3 dph, die Tol2(mpx:Dendra2) exprimierten, um Neutrophile in grün23 zu markieren, wurden durch Schwanzdurchtrennung verwundet und 24 Stunden lang abgebildet (Abbildung 5). Bildgebende Artefakte, die typischerweise mit späten Embryonen mit 3 bis 4 dpf in Verbindung gebracht werden, wie z. B. Kippen und Schweben, waren bemerkenswerterweise nicht vorhanden (Video 4), und das Nachwachsen des Gewebes wurde während des Experiments ungehindert fortgesetzt. Die Rekrutierung von Neutrophilen bis zum Wundrand setzt sich im gesamten Bild fort (Abbildung 5B), wobei die meisten migrierenden Zellen 24 Stunden nach der Wunde wieder verschwinden (Abbildung 5C), was mit der erwarteten Entzündungsauflösung übereinstimmt25,26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Design und Verwendung eines PET-Laminat-Mikrofluidik-Geräts (RADISH). (A) Schematische Veranschaulichung der Anordnung und Dicke der einzelnen PET-Schichten, der Montage und Verwendung des Geräts. (B) Endprodukt, montiert in einem 3/4"-Ausschnitt in einer 35-mm-Schale. (C) 3 dpf-Embryonen, (D) 5 dpf-Embryonen, (E) 14 dpf-Embryonen, die im Gerät untergebracht sind. Maßstabsleisten = 1.000 μm (C,D,E). Abkürzungen: PET = Polyethylenterephthalat; RADISH = Rotationsassistent für die Danio-Bildgebung der nachfolgenden Heilung; dpf = Tage nach der Befruchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Fotografische Schritt-für-Schritt-Illustration der Montage von PET-Geräten. (A) Einzelne PET-Schichten vor dem Laminieren. (B) PET-Schicht, die mit Büroklebeband auf einem 25-mm-Deckglas befestigt ist. (C) Das Gerät in Arbeit ist zur Laminierung auf einer Kunststoffunterlage befestigt. (D) Fertiges PET-Laminatgerät. (E) Modifizierte 35-mm-Schüssel vor der Gerätemontage. (F) Fertiges Gerät. Abkürzung: PET = Polyethylenterephthalat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Verbesserte Qualität der konfokalen Laserscanning-Bilder von 3-dph-Embryonen im RADISH-Design. (A) Repräsentatives Bild eines 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) Embryos, der mit MemGlow 560 gefärbt wurde, ohne den RADISH zu verwenden. (B) Repräsentatives Bild eines Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) Embryos, der mit MemGlow 560 gefärbt wurde, montiert in der RADISH. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzungen: RADISH = Rotationsassistent für die Bildgebung der anschließenden Heilung; dpf = Tage nach der Befruchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Kompatibilität des RADISH-Designs mit mehreren Verwundungstechniken. (A) 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 Embryo, der durch manuelle Schwanzflossendurchtrennung verwundet wurde. (B) Embryo, der durch Laserablation verletzt wurde. (C,D) Die gleichen Embryonen 4 Minuten später, die das Fortschreiten der Kalziumtransienten nach der Verwundung zeigen. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: RADISH = Rotationsassistent für die Bildgebung der anschließenden Heilung; dpf = Tage nach der Befruchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Langzeiteinschluss von Embryonen für die Bildgebung der Phagozytenmigration. (A) Tol2(mpx:Dendra2)- Embryonen unmittelbar nach der Verwundung und dieselben Embryonen (B) 25 min, (C) 12 h und (D) 24 h später. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: Vektor- und PNG-Dateien für das Design von RADISH-Geräten, wie in Abbildung 1A gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Video 1: Hellfeld-Video der manuellen Heckflossendurchtrennung mit dem RADISH-Gerätedesign. Abkürzung: RADISH = Rotational Assistant für Danio Bildgebung der nachfolgenden Heilung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%201.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 2: Vergleich von ungefassten und eingerahmten 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) Embryonen aus Abbildung 3, aufgenommen mit 1 frame/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%202.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 3: Calciumtransienten in Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 Embryonen, die durch Skalpelldurchtrennung oder Laserablation verwundet wurden, aus Abbildung 4, aufgenommen bei 1 frame/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%203.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 4: Langzeitbildgebung der Leukozytenrekrutierung und der Regeneration der Schwanzflosse in Tol2(mpx:Dendra2)- Embryonen. Abkürzungen: RADISH = Rotationsassistent für die Bildgebung der anschließenden Heilung; HPW = Stunden nach der Verwundung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%204.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

Kostengünstige Mikrofluidik-Designs für die Laminierung von Polyethylenterephthalat für die Multiplex-Bildgebung von Zebrafischen

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Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll verwendet Lichtblatt-Bildgebung, um die kontraktile Funktion des Herzens in Zebrafischlarven zu untersuchen und Einblicke in die Herzmechanik durch Zellverfolgung und interaktive Analyse zu gewinnen.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Erfahren Sie kostengünstige Mikrofluidik-Fertigung mit PET-Laminierung für hochauflösende Multiplex-Bildgebung lebender Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht schnellere Iteration und verbesserte räumliche Auflösung gegenüber herkömmlichen PDMS-Geräten.

Kostengünstige Mikrofluidik-Designs für die Laminierung von Polyethylenterephthalat für die Multiplex-Bildgebung von Zebrafischen (Video) | JoVE Journal

Kostengünstige Mikrofluidik-Designs für die Laminierung von Polyethylenterephthalat für die Multiplex-Bildgebung von Zebrafischen

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