Kostengünstige Mikrofluidik-Designs für die Laminierung von Polyethylenterephthalat für die Multiplex-Bildgebung von Zebrafischen

Unser Labor interessiert sich für die Mechanismen, die die Migration und Aktivierung von Neutrophilen bei Gewebeverletzungen, Infektionen und Krebs regulieren, wobei der Schwerpunkt auf den Eigenschaften und der biologischen Bedeutung des intrazellulären Kalzium-Signalwegs bei der Wundheilung liegt.

[Shelly] Herkömmliche mikrofluidische Designmethoden sind kostspielig und komplex, was den Fortschritt in Bereichen wie der Entwicklungsbiologie verlangsamt, die unterschiedliche Umgebungen erfordern. Wir sahen einen schnelleren und effizienteren Ansatz für die Entwicklung und das Testen individueller Designs. Diese Konstruktionsmethode bietet also eine größere Designflexibilität und räumliche Auflösung als ähnlich einfache Protokolle und ermöglicht gleichzeitig eine schnellere und einfachere Iteration als Standard-PDMS-Geräte. Mit ihm haben wir den RADISH entwickelt, um mehrere Zebrafischembryonen gleichzeitig in einem einzigen Sichtfeld abzubilden.

Mit diesem Einklemmgerät, das hochauflösende Bildgebung von Leben unterstützt, können wir verstehen, wie verschiedene Signale, einschließlich chemischer und mechanischer Reize, integriert werden, um Entzündungen und Wundheilung zu koordinieren.

[Dozent] Entwerfen Sie zunächst das Muster für das Gerät mit der Software Ihrer Wahl. Passen Sie je nach Alter und Größe des Embryos die Breite des Kanals und die Größe der zentralen Bildgebungskammer an, um die beste Passform zu erzielen. Speichern Sie jede Ebene als einzelne Bilddatei mit identischen Abmessungen. Initialisieren Sie nun die Schneidemaschine gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wählen Sie im Design-Arbeitsbereich die neu hochgeladenen Designs aus. Gruppieren Sie Modelle, die für die gleiche Dicke von PET-Platten vorgesehen sind, im gleichen Schnitt. Bestätigen Sie die Anzahl und Art der Muster im Schnitt und wählen Sie dann das Schnittmaterial aus. Befestigen Sie anschließend die PET-Folie in der gewünschten Dicke an der Schneidematte, drücken Sie fest, um Luftblasen zu entfernen, und legen Sie die Matte in die Schneidemaschine ein. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Schneidemaschine aufzufordern, mit dem Schnitt zu beginnen. Entfernen Sie dann die fertigen Schnitte von der Schneidematte. Richten Sie nun die Schichten auf einem Deckglas aus, entweder ohne Hilfe oder mit vorgestanzten Passermarken. Sichern Sie die Schichten mit Büroklebeband, um ein Verrutschen während der Laminierung zu vermeiden. Montieren Sie je nach Gerätegröße und Kapazität des Laminiergeräts kleine Designs mit mehr Klebeband auf einer größeren Unterlage, um ein Verklemmen oder Verstopfen des Laminiergeräts zu vermeiden. Schalten Sie anschließend das Laminiergerät ein und laminieren Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers. Entfernen Sie das Büroklebeband, bevor Sie die nächste Schicht ausrichten. Befestigen Sie das Gerät mit Cyanacrylatkleber an einer 35-Millimeter-Schale, die mit einem Dreiviertelzoll-Loch gebohrt ist. Imprägnieren Sie dann das Laminat, indem Sie die äußeren Kanten des Geräts gründlich mit Cyanacrylatkleber beschichten. Verwenden Sie genügend Kleber, um die Außenkanten vollständig und lückenlos abzudecken. Zu Beginn ziehen Sie die Zebrafischembryonen mindestens zwei Tage nach der Befruchtung in E3 oder einem anderen geeigneten Embryoaufzuchtmedium auf. Dann betäuben Sie die Embryonen mit 164 Milligramm MS-222 pro Liter. Füllen Sie dann die Halteschale, in der sich das montierte Gerät befindet, mit fünf Millilitern E3 oder einem anderen Embryomedium, das 164 Milligramm MS-222 pro Liter enthält. Legen Sie mit einer Transferpipette einen betäubten Embryo in jede Haltekammer des Geräts. Richten Sie dann die Embryonen mit einer Haarschlaufe so aus, dass der Schwanz jedes Embryos in die zentrale Bildgebungskammer hineinragt und das Eigelb in dem keilförmigen Kanal immobilisiert wird. Falls gewünscht, sichern Sie den Kopf des Embryos, indem Sie mit einer Mikropipette 1,5 % Low Melt Agarose in die Haltekammer geben. Bewegen Sie schließlich das Gerät mit den Embryonen zum Bildgebungssystem Ihrer Wahl, um mit der Bildgebung zu beginnen. Wählen Sie das geeignete Bildgebungssystem und das Objektiv für das Experiment aus. Passen Sie den Probenfokus und die Bildgebungsparameter an, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis und eine optimale Erfassungsgeschwindigkeit zu erzielen. Um den Embryo durch manuelle Durchtrennung zu wickeln, üben Sie mit einer Skalpellklinge unter einem Stereomikroskop Druck auf das Schwanzflossengewebe an der Spitze der Chorda aus. Stellen Sie das Gerät dann wieder auf die Bühne zurück. Um den Embryo durch Laserstimulation zu wickeln, definieren Sie einen interessierenden Bereich in der Nähe des Randes der Schwanzflossenfalte und stimulieren Sie entsprechend der verfügbaren Laserleistung. Bilden Sie den Embryo bei Raumtemperatur mit dem GFP- und RFP-Kanal mit einem Bildintervall von einer Minute für insgesamt eine Stunde ab. Falls erforderlich, geben Sie die Embryonen nach der Bildgebung frei, indem Sie mit einer Transferpipette vorsichtig in der Nähe des Kopfes ansaugen oder die Schale schwenken.