Name: Identifizierung und Quantifizierung gestörter Metaboliten bei kritisch kranken Patienten mittels NMR-basierter Metabolomik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie NMR-basierte Metabolomik gestörte Metaboliten bei kritisch kranken ARDS-Patienten identifiziert und quantifiziert. Diese Methode ermöglicht personalisierte Behandlungsansätze durch präzise metabolische Profilierung.

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Die ethische Zulassung (IEC-Code: 2022-71-PhD-126) wurde von der IEC des Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences (SGPGIMS), Lucknow, erhalten. Es wurden schriftliche und informierte Einwilligungen von den Patienten oder ihren Angehörigen eingeholt, um die Studie durchzuführen und die Daten zu Forschungszwecken zu veröffentlichen. Darüber hinaus wurde die Forschung nach den institutionellen Richtlinien durchgeführt.
1. Studiendesign und ethische Freigabe
<ol>
	<li>Bestimmen Sie den Stichprobenumfang für jede Gruppe. Überprüfen Sie die Auswahlkriterien für die Teilnehmer sorgfältig und legen Sie sie fest. Wenn das Studiendesign die Einbeziehung von menschlichen oder tierischen Proben erfordert, holen Sie außerdem die ethische Freigabe der zuständigen institutionellen Ethikkommission (IEC) ein, bevor Sie mit der Probenentnahme beginnen.</li>
	<li>Ausgewählte ARDS-Patienten, die als leicht, mittelschwer und schwer eingestuft werden, basierend auf den diagnostischen Kriterien der Definition von Berlin 2012, die auf dem Partialdruck des Sauerstoffs im arteriellen Blut (PaO2) zum Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs (FiO2) (P/F) basiert. Die ARDS-Patienten mit einem P/F-Bereich von 300-200 gelten als leicht, 200-100 als mittelschwer und unter 100 als schwer38. Hier haben wir uns auf zwei Gruppen konzentriert: leichte und mittelschwere ARDS-Patienten (siehe Tabelle 1). HINWEIS: Die Studie umfasst die Verwendung von Serum, das aus Blutproben gewonnen wird, um NMR-basierte Metabolomik durchzuführen. In dieser Studie hatten die als Referenz eingeschlossenen Teilnehmer ein Durchschnittsalter von 42 Jahren (± 10,9 Jahre) mit einer Geschlechterverteilung von 2 Männern und 6 Frauen.</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kategorie</td>
			<td>P/F-Verhältnis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leicht</td>
			<td>300-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mäßig</td>
			<td>200-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwer</td>
			<td>100-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Kategorisierung von ARDS-Patienten.
2. Probenauswahl, -entnahme und -verarbeitung
<ol>
	<li>Führen Sie die Serumisolierung durch, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.<ol>
		<li>Entnehmen Sie zu Experimenten 2 ml Blutproben aus den Arterien mit einer sterilen Nadel in einem glatten (ohne Zusatzstoffe) und sterilen Fläschchen. Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen. Für diese Studie wurden 4 Patienten mit leichtem ARDS und 4 Patienten mit mittelschwerem ARDS ausgewählt.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 3100 x g , um das Serum25 zu trennen. Das Serum wird in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführt, wobei Aliquots mit kleinerem Volumen (d. h. 400-500 μl) erstellt werden, sie entsprechend gekennzeichnet werden (Name des Patienten, CR-Nr., Tagespunkt usw.) und für zukünftige Analysen bei -80 °C gelagert werden. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann das Experiment zu einem geeigneten Zeitpunkt angehalten und fortgesetzt werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Serumprobe vor NMR-Experimenten mit den folgenden Schritten.<ol>
		<li>Tauen Sie die Probe auf, bevor Sie die NMR-Experimente durchführen. Mischen Sie 250 μl Aliquot des Serums mit 250 μl Kochsalzphosphat-Pufferlösung (enthält 100 % D2O, 0,9 % NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4), um pH-Schwankungen zu minimieren.</li>
		<li>Wirbeln Sie die Mischung einige Sekunden lang (~15 s) ein, um sicherzustellen, dass sie homogen vermischt wird. Schließlich wird die vorbereitete Probe in ein sauberes NMR-Röhrchen mit einem koaxialen Einsatz überführt, der Trimethylsilylpropionat (TSP) in einer Konzentration von 0,05 mM enthält, das als externer Standard für die Kalibrierung und Quantifizierung dient41. HINWEIS: Als Referenz wird eine inerte und nicht reaktive Verbindung verwendet, die nicht mit den Analyten interagiert. Weitere häufig verwendete Referenzverbindungen sind Tetramethylsilan (TMS) und Natriumtrimethylsilylpropansulfonat (DSS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. NMR-Experimente
HINWEIS: Der Schwerpunkt liegt auf der Identifizierung kleiner Moleküle in den Serumproben, daher haben wir die Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Pulssequenz verwendet, die Makromolekülsignale unterdrückt. Alle Serumproben in dieser Studie wurden mit einem 800 MHz NMR-Spektrometer aufgezeichnet, das mit einem kryogenisch gekühlten Dreifachresonanz-TCI-Sondenkopf mit 5 mm Breitband und einem abgeschirmten Z-Gradienten ausgestattet war.
<ol>
	<li>Legen Sie die Probe in den Magneten. Schreiben Sie den Befehl wrpa (Experimentnummer angeben) und drücken Sie die Eingabetaste, um ein Protonenexperiment mit dem cpmg-Pulsprogramm einzurichten. Nennen Sie den Namen des Patienten und andere notwendige Details, indem Sie auf die Option Titel klicken.</li>
	<li>Sperren Sie das Magnetfeld, indem Sie den Befehl Lock schreiben , drücken Sie die Eingabetaste und wählen Sie die Option 90% H2O und 10% D2O weiter. Stimmen Sie die Sonde manuell mit ATMM ab, um die Effizienz von Hochfrequenzimpulsen zu optimieren und die Empfindlichkeit zu maximieren. Führen Sie das 1D-Gradienten-Shimming durch, indem Sie auf topshim klicken.</li>
	<li>Stellen Sie die folgenden Erfassungsparameter ein, darunter eine Relaxationsverzögerung von 5 s, eine spektrale Sweep-Breite von 12 parts per million (ppm) und eine Echozeit von 300 μs. Alle diese Parameter können einfach geändert werden, indem Sie die Option Erfassungsparameter im oberen Bereich auswählen.</li>
	<li>Wenden Sie eine Linienverbreiterung von 0,3 Hz mit einer Exponentialfensterfunktion an und sammeln Sie Daten in 64.000 Punkten über 128 Scans. Diese Parameter können auf ähnliche Weise geändert werden, indem Sie die Option Erfassungsparameter im oberen Bereich auswählen. Wenn Sie auf Akquisitionsparameter klicken, erscheint eine Liste der Spezifikationen, und die genannten Attribute können zusammen mit anderen Parametern während der Optimierung geändert werden.</li>
	<li>Erfassen Sie die NMR-Spektren mit NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeugen. Sobald die endgültigen Spektren erhalten sind, schreiben Sie den Befehl apk und absn und drücken Sie die Eingabetaste, um die Phasenkorrektur bzw. die Basislinienkorrektur durchzuführen. Klicken Sie auf die Option Achse kalibrieren im oberen Bereich und kalibrieren Sie den TSP-Peak entweder automatisch oder manuell auf 0 ppm.</li>
	<li>Übertragen Sie die erfassten Daten vom System auf die Workstation, wo die weitere Verarbeitung und Analyse erfolgt. HINWEIS: Die Versuchsphase ist nun abgeschlossen und kann pausiert werden. Die Vorverarbeitung, Analyse und Interpretation von Daten kann bequem durchgeführt werden.</li>
</ol>
4. Vorverarbeitung von Daten
<ol>
	<li>Führen Sie die Datenvorverarbeitung mit NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeugen und NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware durch.<ol>
		<li>Manchmal reicht eine automatische Korrektur nicht aus, und in diesem Fall ist auch eine manuelle Korrektur erforderlich. Um die Phasenkorrektur manuell durchzuführen, klicken Sie auf die Option Verarbeiten in der oberen Menüleiste der NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeuge. Klicken Sie dann auf Phase anpassen, ziehen Sie die Maus und beobachten Sie, bis die Spektren phasenkorrigiert sind. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Option Speichern und Zurückkehren (in Form eines Symbols), die in derselben Menüleiste verfügbar ist.</li>
		<li>Um eine manuelle Baseline-Korrektur (Whittaker-Methode) durchzuführen, öffnen Sie die Spektraldatei im Prozessormodul der NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware. Wählen Sie die Option Baseline-Korrektur aus. Wählen Sie dann die Option Whittaker-Methode. Setzen Sie nun die Punkte an die Basis der Peaks in den gesamten Spektren (0,0 bis 10 ppm, normalerweise im Falle von Serum oder je nach Verfügbarkeit des Metaboliten in den Spektren), um die Basis anzupassen. Nachdem alle Spektraldateien grundlegend korrigiert wurden, speichern Sie sie in einem einzigen Ordner. Die weitere Verarbeitung, entweder unter Verwendung des Prozessors oder des Profiler-Moduls der NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware, kann mit derselben Datei durchgeführt werden, die in dem spezifischen Format gespeichert ist.</li>
		<li>Führen Sie das Binning mit dem Profiler-Modul derselben Software durch. Wählen Sie die Option Extras, dann Stapelverarbeitung und dann Spektrales Binning aus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um das endgültige Binning-Sheet für die statistische Analyse zu generieren, wählen Sie den Ordner aus, der alle baseline-korrigierten Spektraldateien enthält, nachdem Sie auf Spektral-Binning geklickt haben.</li>
	<li>Teilen Sie die Spektren in eine festgelegte Anzahl gleich großer Bins mit einer definierten spektralen Breite auf, die von 0,01 bis 0,04 ppm reicht (kann gemäß der Studie optimiert werden). Dieser Prozess vereinfacht und organisiert die Spektraldaten und ermöglicht so eine konsistentere Analyse. Geben Sie die Bucket-Größe zusammen mit den ppm-Werten für Start und Ende an und legen Sie den Ordner fest, in dem die Ausgabe-Binning-Blätter gespeichert werden.</li>
	<li>Die chemischen Verschiebungsbereiche, die Wasser und dem Lösungsmittel TSP entsprechen (4,8-5,2 und 0,0-0,7 ppm), sind auszuschließen, um spektrale Interferenzenzu vermeiden 42,43,44.</li>
	<li>Diese Tabelle enthält die Stichprobennamen in einer Zeile und die verschiedenen Klassenwerte zusammen mit ppm in den anderen Zeilen. Bevor Sie dieses Blatt für die statistische Analyse verwenden, ändern Sie es, indem Sie die Stichproben für die Analyse in Gruppen organisieren und nur im CSV-Format (Comma-Limited) speichern. HINWEIS: Beim Vergleich der milden Gruppe mit der moderaten Gruppe von ARDS-Patienten haben wir beispielsweise die Daten mit leichten und mittelschweren Beschriftungen versehen, eine Seriennummer hinzugefügt und die Datei im CSV-Format gespeichert.</li>
</ol>
5. Statistische Analyse
HINWEIS: Das Binning-Sheet, das Sie im vorherigen Schritt erhalten haben, dient als Eingabedatei für die statistische Analyse. In dieser Studie wurde das Modul für die statistische Analyse (ein Faktor) der statistischen Analysesoftware für die Metabolomik verwendet.
<ol>
	<li>Führen Sie vor der statistischen Analyse den Normalisierungsschritt mit Summe, Logarithmus und Pareto durch, der jedoch in verschiedenen Studien variierenkann 45.</li>
	<li>Führen Sie univariate und multivariate Analysen durch, um die verschiedenen Gruppen zu unterscheiden und die Genauigkeit der identifizierten Metaboliten zu bestimmen.<ol>
		<li>Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA), eine partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) und eine orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) durch, um die Unterscheidung zwischen den Gruppen zu beobachten, die für jeden Metaboliten, der für den Unterschied im Stoffwechselprofil verantwortlich ist, zu VIP-Werten (Variable Importance of Projection) führt.</li>
		<li>Führen Sie univariate Methoden durch, wie z. B. den studentischen t-Test und die ANOVA, um die signifikanten Metaboliten auf der Grundlage des Kriteriums eines p-Werts von weniger als 0,05 zu identifizieren. Beide Tests liefern Box-Whisker-Diagramme, die den Unterschied in der relativen Konzentration der Metaboliten zeigen.</li>
		<li>Führen Sie eine Biomarker-Analyse durch, die einen Bereich unter dem AUROC-Diagramm (Receiver Operating Characteristic Curve) ergibt. Der AUC-Wert (Fläche unter der Kurve) &gt; 0,8 gilt als signifikant46.</li>
		<li>Wählen Sie die endgültige Liste der signifikanten Metaboliten anhand der Kriterien VIP-Score&gt;1, Bonferroni-korrigierter p-Wert&lt;0,0544 und AUC &gt; 0,846 aus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifizieren Sie die Metaboliten wie unten beschrieben.<ol>
		<li>Binning liefert signifikante Metaboliten in Form von ppm-Werten anstelle von Namen. Identifizieren Sie die Metaboliten, die bestimmten ppm-Werten entsprechen, mithilfe von Datenbanken wie der Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB)47und der Human Metabolome Database (HMDB).</li>
		<li>Verwenden Sie außerdem bereits veröffentlichte Literatur42,44 zur Identifizierung und Validierung.</li>
		<li>Verwenden Sie das Profiler-Modul der NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware, um die identifizierten Metaboliten mit ihren ppm-Werten zu bestätigen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Quantifizierung von Metaboliten mit Hilfe von NMR-Software zur Quantifizierung von Metaboliten
HINWEIS: Das Profiler-Modul der Software wird häufig verwendet, um die identifizierten Metaboliten zu quantifizieren.
<ol>
	<li>Bevor Sie mit der Quantifizierung beginnen, kalibrieren Sie die für die Studie ausgewählte Referenzsubstanz (in dieser Studie verwendeter TSP) mit dem Prozessormodul. Klicken Sie auf die Option CSI kalibrieren (chemischer Formindikator). Nennen Sie die Konzentration der Referenzverbindung (0,05 mM für diese Studie). Ziehen Sie dann den Software-Peak auf den spektralen Referenzpeak und passen Sie dessen Höhe und Breite richtig an. Sobald die spektralen Referenzpeaks mit dem Peak der Software übereinstimmen, klicken Sie auf Akzeptieren.</li>
	<li>Öffnen Sie die gewünschten Spektren im Profiler-Modul und wählen Sie die entsprechende Verbindungsbibliothek für die Studie aus.</li>
	<li>Am unteren Rand des Bildschirms wird eine Liste der Metaboliten angezeigt. Wählen Sie den gewünschten Metaboliten aus dieser Liste aus. Nach der Auswahl erscheinen die möglichen ppm des gewählten Metaboliten in der oberen Ecke der Spektren.</li>
	<li>Wählen Sie den ppm-Wert in der oberen Ecke aus und zoomen Sie in die Spektren auf die spezifische ppm-Skala des Metaboliten.</li>
	<li>An diesem Punkt erscheinen zwei Peaks auf dem Bildschirm: Einer stellt die aufgezeichneten Daten dar und der andere, der als gepunktete Linie dargestellt wird und den Software-Peak darstellt. Richten Sie beide Spitzen aus. Ziehen Sie den Software-Peak und passen Sie seine Höhe und Position an den im Sample vorhandenen Peak an.</li>
	<li>Nach der richtigen Ausrichtung kann die Konzentration des Metaboliten aus dem Wert ermittelt werden, der unter der Überschrift Konzentration in mM für diesen Metaboliten angezeigt wird (Abbildung 1).</li>
	<li>Befolgen Sie das gleiche Verfahren für alle Metaboliten und Proben und exportieren Sie die quantifizierten Werte in eine Tabelle. Um die Ausgabedatei zu generieren, klicken Sie im Menü Extras auf die Option Batch-Operationen. Geben Sie den gewünschten Ordner zum Speichern der Ausgabedatei an.</li>
</ol>
7. Analyse des Signalwegs
HINWEIS: Die nach der Analyse identifizierten signifikanten Metaboliten werden verwendet, um die Hauptsignalwege zu bestimmen, die das Ergebnis in Krankheitsgruppen direkt beeinflussen. Hierfür werden in der Regel das Modul Signalweganalyse der statistischen Analysesoftware Metabolomics und die Datenbank KEGG eingesetzt.
<ol>
	<li>Geben Sie die erhaltene Liste der signifikanten Metaboliten in das Modul ein. Es wird eine Liste mit den Namen der Pfade generiert.</li>
	<li>Wählen Sie die endgültigen Pfade basierend auf dem Kriterium eines Impact-Faktors größer als 0,1 aus. Signifikante Wirkungswerte deuten auf krankheitsbezogene Signalwegehin 30.</li>
	<li>Analysieren Sie die resultierenden Signalwege gründlich, um die mit der Schwere der Erkrankung verbundene Dysregulation aufzuklären. Einer der Nachteile dieser Methode ist ihre Ineffizienz bei der Identifizierung der fehlregulierten Signalwege, wenn die signifikanten Metaboliten weniger als 3 betragen.</li>
	<li>Um dies zu bewältigen, kann der identifizierte Metabolit und seine Korrelation mit dem Schweregrad der Erkrankung auch anhand der zuvor veröffentlichten Literatur bestimmt werden. Führen Sie eine gründliche Literaturrecherche durch und beobachten Sie, ob der identifizierte Metabolit auch dem gleichen Trend folgt, der Ihren Interessen entspricht.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Grundlegende Schritte in der NMR-basierten Metabolomik. Die Abbildung zeigt die wichtigsten Schritte der NMR-basierten Metabolomik: Entnahme und Aufbereitung von Proben, Durchführung der NMR-Spektroskopie, Vorverarbeitung von Daten, Durchführung statistischer Analysen, Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten und Interpretation der biologischen Signifikanz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Metabolomik mittels NMR-Spektroskopie zur Identifizierung von fehlregulierten Metaboliten

<table><tbody><tr><td>Centirfuge</td><td>Sigma aldrich</td><td>3-18KS</td><td></td></tr><tr><td>Chenomx NMR-Suite&nbsp;</td><td>NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Kanada</td><td></td><td>Software zur Quantifizierung von NMR-Metaboliten</td></tr><tr><td>Co-axialer Einsatz</td><td>Sigma aldrich</td><td>Z278513</td><td></td></tr><tr><td>Deuterimoxid</td><td>Sigma aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Tarsons</td><td>500020</td><td></td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td>Wishart Research Group</td><td></td><td>Metabolomics statistische Analysesoftware</td></tr><tr><td>NMR-Röhrchen</td><td>Wilmad</td><td>Z412007</td><td>5mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf research plus</td><td>3123000039</td><td>0-100 &mu; l</td></tr><tr><td>Fläschchen für die Probenentnahme</td><td>Tarsons Kryo-Kühlfläschchen</td><td>523194</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloridkristall</td><td>Sigma aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma aldrich</td><td>567550</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Topspin 3.6.4</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeug</td></tr><tr><td>Tsp-Salz</td><td>Sigma aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung und quantifizierung gestörter metaboliten bei kritisch kranken patienten mittels nmr-basierter metabolomik

Identification and Quantification of Deranged Metabolites in Critically Ill Patients Using NMR-Based Metabolomics

Um eine Metabolomik-Studie durchzuführen, ist es wichtig, die Stichprobengröße und die spezifischen Gruppen zu bestimmen, die analysiert werden sollen. Die Auswahl einer angemessenen Stichprobengröße ist unerlässlich, um signifikante Ergebnisse zu erhalten, die genau mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren48. In dieser speziellen Arbeit haben wir jedoch eine kleine Stichprobengröße verwendet, um die Schritte bei der Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten mit Hilfe der NMR-basierten Metabolomik zu demonstrieren, die in erster Linie als Referenz gedacht war. In dieser Studie untersuchten wir die metabolischen Unterschiede zwischen Patienten im leichten und mittelschweren Stadium des ARDS am Tag 1 ihrer Aufnahme auf die Intensivstation, an denen insgesamt 8 Probanden teilnahmen. Gemäß dem Protokoll wurden die NMR-Spektren aller Proben erfasst und verarbeitet, und schließlich wurde eine Tabelle mit den Binning-Ergebnissen erstellt.
Anschließend führten wir eine strenge statistische Analyse durch, bei der die Binning-Sheets als Eingabedateien verwendet wurden, wobei die Daten mit Summe, Protokoll und Pareto normalisiert wurden. Wir führten PCA (Abbildung 2A) und OPLS-DA (Abbildung 2B) durch, wobei erstere eine Clusterbildung zeigten, letztere jedoch eine klare Unterscheidung zwischen den Gruppen aufwies und metabolische Unterschiede hervorhob. Die statistische Analyse des Permutationstests (20x) ergab Werte von R2Y = 0,99 und Q2 = 0,47. Anschließend führten wir einen studentischen t-Test (Abbildung 2C) und eine Biomarker-Analyse (Abbildung 2D) durch, um fehlregulierte Metaboliten zu identifizieren. Den im Protokollabschnitt beschriebenen Kriterien folgend, filterten wir die Ergebnisse nach den signifikanten Metaboliten (Tabelle 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Multivariate und univariate Analyse. (A) Hauptkomponentenanalyse (PCA) und (B) Orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) von milden ARDS-Patienten (dargestellt durch rote Farbe) und moderaten ARDS-Patienten (dargestellt durch grüne Farbe). (C) Die Box-cum-Whisker-Diagramme verdeutlichen die Unterschiede in der relativen Konzentration von Metaboliten zwischen leichten und mittelschweren ARDS-Patienten, die mittels Protonenkernspinresonanzspektroskopie in Serumproben nachgewiesen wurden. Die x-Achse stellt die Studiengruppen dar, und die y-Achse zeigt die relative Konzentration, wenn leichte ARDS-Patienten (dargestellt durch rote Farbe) und mittelschwere ARDS-Patienten (dargestellt durch grüne Farbe) am Tag 1 der Aufnahme auf die Intensivstation verglichen wurden. (D) Das Diagramm der Fläche unter der Kurve (AUC) mit signifikanten Metaboliten, die den Schweregrad vorhersagen, erhalten nach Durchführung einer Biomarker-Analyse zum Vergleich von leichten und mittelschweren ARDS-Patienten am Tag 1 der Aufnahme auf die Intensivstation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S.No.</td>
			<td>Name</td>
			<td>Spektrale Lage (ppm)</td>
			<td>p-Wert</td>
			<td>VIP</td>
			<td>AUC-Wert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Lactat</td>
			<td>1.34</td>
			<td>0.04</td>
			<td>1.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Isoleucin</td>
			<td>1.42</td>
			<td>0.03</td>
			<td>2.01</td>
			<td>0.875</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Liste signifikanter Metaboliten, die nach dem Vergleich von leichten und mittelschweren ARDS-Patienten am Tag 1 der Aufnahme auf die Intensivstation erhalten wurden.
Da die Ergebnisse in ppm-Werten erhalten wurden, haben wir die Metaboliten anhand der bisherigen Literatur zugeordnet und mit dem Profiler validiert. Nach der Zuordnung wurden Laktat und Isoleucin als signifikante Metaboliten erhalten, die auch in einigen früheren ARDS-Studien berichtet wurden30,40. Wir stellten sicher, dass gut aufgelöste, nicht überlappende Peaks ausgewählt wurden. Nach der Identifizierung filterten wir die Liste der signifikanten Metaboliten anhand der im Protokoll genannten Kriterien. Anschließend quantifizierten wir die interessierenden Metaboliten mit dem Profiler-Modul, indem wir die Spektren öffneten, nach dem interessierenden Metaboliten suchten und den Software-Peak an den in den Spektren erhaltenen Peak anpassten. Daraus ergaben sich die quantifizierten Werte der Metaboliten in mM. Als Referenz wurde eine Tabelle mit Probennamen, Metabolitennamen und Konzentrationen erstellt. Nach der Quantifizierung mit der Software kann eine Validierung durch andere Ansätze, wie z.B. Proteomik, durchgeführt werden.
Darüber hinaus werden die identifizierten Metaboliten gründlich analysiert, um ihre Korrelation mit der Schwere der Erkrankung zu bestimmen und die biochemischen Signalwege zu identifizieren, an denen diese Metaboliten aktiv beteiligt sind. Da nach Anwendung der im Material- und Methodenabschnitt genannten Kriterien nur zwei signifikante Metaboliten identifiziert werden konnten, war eine Signalweganalyse mit der Software nicht möglich. Daher wurde eine gründliche Literaturrecherche durchgeführt, um die gestörten Stoffwechselzyklen hervorzuheben. Die beiden in dieser Studie identifizierten Metaboliten korrelierten erfolgreich mit dem Schweregrad von ARDS. Erhöhtes Laktat bedeutete Lungenentzündung und anaerobe Atmung, während erhöhtes Isoleucin auf Proteinkatabolismus hindeutete, der mit Lungenverletzungen, Infektionen und Energiestoffwechsel verbunden war40. Das Verständnis dieser Stoffwechselwege dient einem doppelten Zweck. Zum einen zeigt es die Komplexität der Krankheit auf und gibt Einblicke in ihre biologischen Mechanismen. Zweitens unterstützt es den therapeutischen Fortschritt, indem es Ärzte bei der Anpassung von Behandlungen an Patienten anleitet und letztendlich die klinischen Ergebnisse verbessert.

Identifizierung und Quantifizierung gestörter Metaboliten bei kritisch kranken Patienten mittels NMR-basierter Metabolomik

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