Identifizierung und Quantifizierung gestörter Metaboliten bei kritisch kranken Patienten mittels NMR-basierter Metabolomik

Unsere Forschung nutzt NMR-basierte Metabolomik, um dysregulierte Metaboliten und biochemische Signalwege zu identifizieren, die bei kritisch kranken Intensivpatienten verändert werden, und wir haben auch Patienten mit ARDS, einer schweren Lungenerkrankung, eingeschlossen. Durch die Erstellung von Profilen und den Vergleich der metabolischen Signaturen wollen wir die biochemischen Störungen aufdecken, die mit dem Fortschreiten der Krankheit verbunden sind, und Behandlungen anpassen, um die Ergebnisse zu verbessern. Tatsächlich versuchen wir, die Lücke im Verständnis der metabolischen Dysregulation bei allen Kategorien von ARDS-Patienten zu schließen, zu denen leichte, mittelschwere und schwere ARDS-Patienten gehören.

Um unsere Erkenntnisse zu verbessern, um die Krankheit und ihr Fortschreiten besser zu verstehen, mit dem übergeordneten Ziel, das Patientenergebnis durch die Bereitstellung präziser und personalisierter Medizin zu verbessern. Die NMR bietet eine einfache Probenvorbereitung, bewahrt die Serumintegrität für die Reanalyse und weist bekannte und unbekannte Metaboliten ohne chemische Derivatisierung nach. Es liefert reproduzierbare, quantitative Daten und gewährleistet eine zuverlässige Metabolitenmessung.

Im Gegensatz zu zielgerichteten Ansätzen ermöglicht die NMR eine sensible, unvoreingenommene Erforschung metabolischer Veränderungen und ist damit ideal für die Entdeckung von Signaturen und Signalwegen im Krankheitsverlauf. Unsere Ergebnisse werden die ARDS-Forschung verbessern, indem sie metabolische Veränderungen in verschiedenen Stadien aufdecken, die noch wenig untersucht sind. Mit Hilfe der NMR-basierten Metabolomik wollen wir dysregulierte Metaboliten und Signalwege identifizieren, die zu potenziellen Signaturen für die Früherkennung, Prognose, rechtzeitigere Vorhersage und Behandlung führen.

Dieser Ansatz fördert das personalisierte Management und vertieft das Wissen über die Erstellung von Stoffwechselprofilen in mehreren Zuständen. Unsere Ergebnisse ebneten den Weg für neue wissenschaftliche Fragen, wie z.B.: Wie beeinflussen spezifische Metaboliten, die in verschiedenen Stadien des ARDS identifiziert wurden, das Fortschreiten der Krankheit? Können diese dysregulierten Signalwege für frühe therapeutische Interventionen ins Visier genommen werden?

Außerdem, wie variieren diese metabolischen Veränderungen bei anderen Atemwegs- oder Entzündungserkrankungen? Sammeln Sie zunächst mit einer sterilen Nadel zwei Milliliter Blut aus den Arterien eines Patienten, bei dem ein leichtes oder mittelschweres akutes Atemnotsyndrom oder ARDS diagnostiziert wurde. Füllen Sie das Blut in ein steriles Fläschchen und lassen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen.

Zentrifugieren Sie das geronnene Blut bei 3.100 g für 15 Minuten, um das Serum zu trennen. Das Serum wird in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführt, wobei Aliquote von 400 bis 500 Mikrolitern hergestellt werden. Beschriften Sie die Röhrchen mit den Daten des Patienten und lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius.

Mischen Sie für NMR-Experimente 250 Mikroliter des Serumaliquots mit 250 Mikrolitern Kochsalzphosphatpuffer, um die Schwankungen des pH-Werts zu minimieren. Wirbeln Sie die Mischung ca. 15 Sekunden lang, um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Die vorbereitete Probe wird in ein sauberes NMR-Röhrchen mit einem koaxialen Einsatz überführt, der TSP in einer Konzentration von 0,05 Millimolar enthält.

Setzen Sie als Nächstes den NMR-Schlauch in den Magneten ein. Geben Sie WRPA ein und wählen Sie die entsprechende Experimentnummer aus, um ein Protonenexperiment mit dem CPMG-Pulsprogramm einzurichten. Klicken Sie auf die Option Titel, um den Namen des Patienten und andere notwendige Details einzugeben.

Geben Sie lock ein und drücken Sie die Eingabetaste, um das Magnetfeld zu sperren. Wählen Sie dann die Optionen 90 % Wasser und 10 % Deuteriumoxid. Geben Sie dann ATMM ein, und drücken Sie die Eingabetaste, um die Optimierung und den Abgleich des Tests durchzuführen.

Wählen Sie anschließend aus der Option Erfassungsparameter die Parameter als 64.000 Punkte über 128 Scans aus, um Optimierungsdaten zu sammeln. Legen Sie die Relaxationsverzögerung auf fünf Sekunden, eine spektrale Sweep-Breite von 12 PPM und eine Echozeit von 200 Mikrosekunden fest, die 300 Mal wiederholt wird. Wenden Sie eine Linienverbreiterung von 0,3 Hertz mit einer Exponentialfensterfunktion an.

Erfassen Sie anschließend mit den NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeugen die NMR-Spektren. Sobald die endgültigen Spektren erhalten sind, geben Sie APK und ABSN ein, um die Phasenkorrektur bzw. die Basislinienkorrektur durchzuführen. Klicken Sie dann im oberen Bereich auf die Option Achse kalibrieren und kalibrieren Sie den TSP-Peak auf 0 PPM, entweder automatisch oder manuell.

Übertragen Sie abschließend die erfassten Daten vom NMR-System zur weiteren Analyse auf die Workstation. Nach der Erfassung von NMR-Spektren von Patienten, bei denen leichtes oder mittelschweres ARDS diagnostiziert wurde, öffnen Sie die NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware für die Datenverarbeitung. Um eine manuelle Baseline-Korrektur mit der Whitaker-Methode durchzuführen, öffnen Sie die Spektraldatei im Prozessormodul der NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware.

Wählen Sie "Basislinienkorrektur" und dann die Whitaker-Methode aus. Platzieren Sie Punkte an der Basis von Peaks in den gesamten Spektren. Speichern Sie nach Abschluss des Vorgangs die baseline-korrigierten Spektraldateien in einem einzigen Ordner.

Um als Nächstes ein spektrales Binning mit dem Profiler-Modul durchzuführen, wählen Sie die Tools, dann Batch-Verarbeitung und dann Spektrales Binning aus. Um das endgültige Binning-Sheet für die statistische Analyse zu generieren, wählen Sie den Ordner mit allen baseline-korrigierten Spektraldateien aus. Teilen Sie die Spektren in gleich große Bins mit einer definierten Spektralbreite von 0,01 bis 0,04 Teilen pro Million auf.

Geben Sie die Bucket-Größe sowie die PPM-Start- und Endwerte an. Wählen Sie einen Ordner aus, in dem die Ausgabe-Binning-Blätter gespeichert werden sollen. Die chemischen Verschiebungsbereiche, die Wasser und dem Lösungsmittel TSP entsprechen, sind auszuschließen, um spektrale Interferenzen zu vermeiden.

In der endgültigen Tabelle werden die Beispielnamen in einer Zeile und die Abschnittswerte mit den entsprechenden PPM-Werten in den anderen Zeilen angezeigt. Bevor Sie eine statistische Analyse durchführen, normalisieren Sie die Daten mithilfe einer Normalisierung, einer Protokolltransformation und einer Pareto-Skalierung. Führen Sie für die multivariate Analyse die Hauptkomponentenanalyse, die partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate und die orthogonale Diskriminanzanalyse der partiellen kleinsten Quadrate durch, um die Unterscheidung zwischen den Gruppen zu beobachten, was zu einer variablen Bedeutung der Projektionswerte für jeden Metaboliten führt, der für den Unterschied im Stoffwechselprofil verantwortlich ist.

Führen Sie den Student-t-Test durch, um signifikante Metaboliten mit einem p-Wert von weniger als 0,05 zu identifizieren. T-Tests erzeugen Box-Whisker-Diagramme, die Unterschiede in den Metabolitenkonzentrationen zeigen. Führen Sie dann eine Biomarker-Analyse durch, um einen Bereich unter dem Betriebskennliniendiagramm des Empfängers zu generieren.

Wählen Sie die endgültige Liste signifikanter Metaboliten basierend auf einer variablen Bedeutung des Projektionswerts größer als eins, einem Bonferroni-korrigierten p-Wert von weniger als 0,05 und einer Fläche unter der Kurve von mehr als 0,8 aus. Identifizieren Sie mit Hilfe der Human Metabolome Database die Metaboliten, die spezifischen PPM-Werten entsprechen. Bevor Sie mit der Quantifizierung beginnen, kalibrieren Sie mit dem Prozessormodul die für die Studie ausgewählte Referenzverbindung.

Klicken Sie auf die Option Chemischen Verschiebungsindikator kalibrieren und geben Sie die Konzentration der Referenzverbindung ein. Ziehen Sie den Software-Peak auf den spektralen Referenzpeak und passen Sie dessen Höhe und Breite an. Sobald die spektralen Referenzpeaks mit dem Peak der Software übereinstimmen, klicken Sie auf Akzeptieren.

Öffnen Sie anschließend die gewünschten Spektren im Profiler-Modul und wählen Sie die entsprechende Verbindungsbibliothek für die Untersuchung aus. Am unteren Rand des Bildschirms wird eine Liste der Metaboliten angezeigt. Wählen Sie den gewünschten Metaboliten aus der Liste aus.

Klicken Sie auf den PPM-Wert in der oberen Ecke des Bildschirms. Vergrößern Sie die Spektren auf die spezifische PPM-Skala des Metaboliten. An dieser Stelle erscheinen zwei Peaks auf dem Bildschirm, von denen einer die aufgezeichneten Daten und der andere als gestrichelte Linie den Software-Peak darstellt.

Ziehen Sie den Software-Peak, um ihn an dem aufgezeichneten Peak auszurichten, und passen Sie die Höhe und Position entsprechend an. Sobald die Peaks richtig ausgerichtet sind, lesen Sie die Konzentration des Metaboliten anhand des Wertes ab, der unter der Überschrift Konzentration in Millimolar angezeigt wird. Um die Ausgabedatei zu generieren, klicken Sie im Menü Extras auf die Option Stapeloperationen und geben Sie den gewünschten Ordner zum Speichern der Ausgabedatei an.

Die Hauptkomponentenanalyse zeigte ein deutliches Clustering zwischen leichten und mittelschweren ARDS-Patientengruppen. Die orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate zeigte eine klare Trennung zwischen der milden und der moderaten ARDS-Gruppe, wobei metabolische Unterschiede hervorgehoben wurden. Der t-Test und die Biomarker-Analyse der Studenten zeigten wichtige fehlregulierte Metaboliten zwischen leichtem und mittelschwerem ARDS.

Laktat und Isoleucin wurden als signifikant dysregulierte Metaboliten identifiziert, die mit dem Schweregrad des ARDS korrelieren.