Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Unsere Bemühungen konzentrieren sich derzeit darauf, die bestehende Korrelation zwischen epigenetischen Veränderungen und metabolischer Neuverdrahtung besser zu charakterisieren, mit dem ultimativen Ziel, neue epigenetische therapeutische Ziele zu identifizieren. Angesichts der Dynamik und des reversiblen Charakters der epigenetischen Modifikation wurden in letzter Zeit mehrere Epidrug-Wirkstoffe entwickelt, die zu einer Verbesserung der Krebsbehandlung und einer Verringerung der Chemoresistenz führen. In jüngster Zeit wurden dank der Anwendung moderner Massenspektrometrie in Verbindung mit den Trenntechniken wie der Top-Page- oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erhebliche Fortschritte auf dem Gebiet der Instanzcharakterisierung erzielt.

Die größte Herausforderung bei der Charakterisierung von Histon besteht darin, dass unzählige Histon-Proteoformen vorhanden sind, die sich aus der Wechselwirkung zwischen dynamisch modifizierten Enzymen und der Verfügbarkeit von Metaboliten ergeben. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Mini-TAU-Gels für ein Mini-Elektrophoresesystem aus vertikalem Polyacrylamid-Gel. Lösen Sie dazu sechs molare Harnstoffe in einer Lösung aus 15 % Acrylamid-Bis-Acrylamid und einem Milliliter Reinstwasser unter sanftem Rühren bei Raumtemperatur auf.

Fügen Sie dann die anderen Komponenten hinzu und passen Sie die Lautstärke an. Füllen Sie die voreingestellten Gelplatten mit dieser Lösung, achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden, und lassen Sie 1,5 Zentimeter von der Oberseite entfernt. Fügen Sie einen Milliliter Isopropanol hinzu, um das Gel zu nivellieren.

Zur Herstellung des Stapelgels auflösen, Harnstoff in einem 6%igen Acrylamid, Bis-Acrylamid mit einem Milliliter Reinstwasser auflösen. Nachdem Sie die anderen Komponenten hinzugefügt haben, füllen Sie die Gelplatten mit dieser Lösung und führen Sie einen 10-Well-Kamm zwischen die Platten ein, bis die Lösung die Hälfte der Zähne des Kamms erreicht. Als nächstes lösen Sie sechs molare Harnstoff, 5 % Eisessig und doppelt destilliertes Wasser, um 100 Mikroliter TAU-Probenpuffer herzustellen.

Lösen Sie dann die lyophilisierte Histonprobe in 30 Mikrolitern TAU-Probenpuffer auf. Füllen Sie die Mini-Kassette mit TAU Laufpuffer mit einer Endkonzentration von 5% Essigsäure. Spülen Sie die Vertiefungen des Gels mit einer Spritze mit laufendem Puffer und laden Sie die Probe mit einer Mikropipette in die Vertiefungen.

Verbinden Sie dann die Elektrophoresekammer mit dem Netzteil und platzieren Sie die positive Elektrode an der Unterseite. Schalten Sie gelegentlich die Stromversorgung aus und spülen Sie die Gelvertiefungen mit einer Spritze aus, um Blasen von der Unterseite des Gels zu entfernen. Nachdem Sie das Gel von den Gelplatten entfernt haben, schneiden Sie mit einem sauberen Skalpell die gewünschte Spur ab.

Waschen Sie nun die Gelbahn mit 15 Millilitern 0,5 M Trishydrochlorid, pH 8,8 für 15 Minuten. Bereiten Sie 15 Milliliter Äquilibrierungspuffer eins und zwei mit den hier gezeigten Komponenten vor. Lagern Sie dann den Äquilibrierungspuffer zwei im Dunkeln.

Inkubieren Sie nun die Gelbahn in 10 Millilitern Äquilibrierungspuffer eins unter leichtem Rühren für 15 Minuten und dekantieren Sie dann. Danach inkubieren Sie die Gelbahn in 10 Millilitern Äquilibrierungspuffer zwei unter leichtem Rühren 15 Minuten lang im Dunkeln, bevor Sie sie dekantieren. Bereiten Sie als Nächstes ein 15%iges Acrylamid-Auflösungsgel mit der hier gezeigten Zusammensetzung vor.

Stellen Sie die Gelplatte auf und füllen Sie sie mit der auflösenden Gellösung, wobei Sie 1,5 Zentimeter vom Ende der langen Gelplatte entfernt bleiben. Fügen Sie einen Milliliter Isopropanol hinzu, um das Gel zu nivellieren und polymerisieren zu lassen. Sobald das Gel polymerisiert ist, dekantieren Sie das Isopropanol und trocknen Sie die Vertiefung mit drei mm Zellulosechromatographie-Papier.

Führen Sie die geschnittene Gelbahn mit einer Pinzette in die Vertiefung des Auflösungsgels ein, um Luftblasen zu vermeiden, und versiegeln Sie dann die Gelbahn mit 0,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Trisglycin und SDS-Puffer mit fünf Mikrolitern 0,003 % Bromphenolblau. Legen Sie die Gelplatten in die Kassette und füllen Sie sie mit Trisglycin und SDS-Puffer. Lassen Sie das Gel bei 120 Volt laufen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff den Boden erreicht.

Entfernen Sie nach dem Laufen vorsichtig das Gel von den Platten und entsorgen Sie die überschüssige Agarose. Führen Sie zunächst eine Mini-2D-Gel-Tritonsäure-Harnstoff- oder TAU-Elektrophorese an Histonproben durch, gefolgt von einer Silberfärbung. Bereiten Sie dann die hier gezeigten Reagenzien vor.

Entfernen Sie mit einem sauberen Skalpell interessante Histonflecken aus dem gefärbten Gel und geben Sie jeden Fleck in ein frisches 1,5-Milliliter-Silikonröhrchen, um eine Kreuzkontamination der Isoform zu vermeiden. Geben Sie 250 Mikroliter 50 millimolare Ammoniumbicarbonat oder 50 % Acetonnitro zu jedem Gelfleck und inkubieren Sie unter sanftem Rühren in einem Thermomischer bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie die Lösung und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, bis die Gelstücke transparent erscheinen.

Um die Gelflecken zu dehydrieren, fügen Sie 200 Mikroliter Acetonnitrol hinzu. Während dieses Schritts werden die Gelstücke undurchsichtig weiß. Dekantieren Sie das Acetonnitril und lassen Sie die Gelflecken 10 Minuten lang an der Luft trocknen.

Die Gelstücke erscheinen trocken in den Tuben. Als nächstes rehydrieren Sie die Gelflecken, indem Sie 20 Mikroliter Trypsinlösung oder genug Volumen hinzufügen, um die Gelstücke zu bedecken. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem Thermomischer bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren für mindestens vier Stunden und bis zu 16 Stunden.

Den Überstand, der die Triptychon-Peptide enthält, in ein frisches Röhrchen umfüllen. Geben Sie 50 Mikroliter Extraktionslösung zu den Gelstücken und beschallen Sie sie zweimal in einem Ultraschall-Wasserbad für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand, der die zusätzlichen Triptychon-Peptide enthält, in dasselbe frische Röhrchen.

Verwenden Sie einen Lyophilisator, um die gepoolten extrahierten Peptide bei 30 Grad Celsius zu trocknen. In der Tube bildet sich ein lyophilisiertes Pellet. Geben Sie nun 15 Mikroliter 0,1 % Trifluoressigsäure in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es vorsichtig in einem Thermomischer bei 25 Grad Celsius.

Übertragen Sie den Überstand in ein Fläschchen für die Flüssigchromatographie, Tandem- und Massenspektrometrie-Analyse.