Name: Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Lernen Sie die 2D-TAU-Gelelektrophorese zur Charakterisierung von Histon-Proteoformen in der Epigenetik. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele für die Krebsbehandlung.

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<meta charset="utf8"></head><body>2D-Geltrennung für die Anreicherung von Histon-Isoformen und die PTM-Charakterisierung

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithioerythrit</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D8255&nbsp;</td><td>Reagenz zur Aufrechterhaltung &minus; SH-Gruppen im reduzierten Zustand; Reduziert quantitativ Disulfide.</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCL Puffer, pH 8,8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>Auflösender Gelpuffer</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS&nbsp;</td><td>BIO-RAD&nbsp;</td><td>1610772</td><td>Verwenden Sie diesen vorgemischten 10x Tris/Glycin/SDS-Laufpuffer, um Proteinproben mittels SDS-PAGE zu trennen.</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>2-Propanol (Isopropanol) ist ein sekundärer Alkohol. Es wurde als Ersatz für Kraftstoff für den Einsatz in verschiedenen Brennstoffzellen getestet. In 2-Propanol gelöstes CuO-Pulver wird für die laserablationsunterstützte Synthese von Cu-Kolloiden verwendet. Die Suspension von 2-Propanol mit Zn(NO3)2 wurde für die Herstellung einer mit Titandioxid beschichteten Photoanode aus rostfreiem Stahl (P25-TiO2/SS) verwendet, die mit einer gleichmäßig dicken Schicht aus P25-TiO2 beschichtet ist. Diese Photoanode wurde für den elektrochemischen photokatalytischen (ECPC) Degradationsprozess verwendet.</td></tr><tr><td>30% Acrylamid/Bis-Lösung&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>2,6 % Vernetzer. Reagenz zur Elektrophorese-Reinheit&nbsp;</td></tr><tr><td>Essigsäure Gletscher</td><td>Carlo Erba Reagennts 401392</td><td></td><td>Essigsäure ist ein wichtiges chemisches Reagenz mit vielen industriellen Anwendungen.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>Aceton&nbsp; ist ein Lösungsmittel, das für seine Vielseitigkeit in verschiedenen Labor-, Fertigungs- und Reinigungsanwendungen bekannt ist.</td></tr><tr><td>Acetonitil</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>für HPLC&nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td> in LC-MS-Qualität <td> ist a&nbsp; Heteropolysaccharid&nbsp; Häufig in der Molekularbiologie verwendet.</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>mindestens 99,0%</td></tr> <tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>Für die Molekularbiologie, Für die Elektrophorese, &ge; 98%&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>Reduktionsmittel zur Reduzierung von Disulfidbindungen in Proteinen.</td></tr><tr><td>Dodeca Silber-Flecken-Kit&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>Das Dodeca-Silberfärbekit ist einfach zu verwenden für den Nachweis von Nicht-Agramm-Spiegeln von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>GE - Gesundheitswesen Life Sciences</td><td>171325010L</td><td>Glycerin ist eine einfache Triolverbindung, die an der Unterstützung beim Gießen von Gradientengelen, Proteinstabilisatoren und Speicherpufferkomponenten beteiligt ist.</td></tr><tr><td>Stopp Phosphatase-Hemmer&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>Thermo Scientific Halt Phosphatase-Inhibitor-Cocktail bewahrt den Phosphorylierungszustand von Proteinen während und nach der Zelllyse oder der Extraktion von Gewebeproteinen. Einweg-Cocktail (100x).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Stoppen Sie den Proteasehemmer&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt Proteaseinhibitor Cocktail (100X) sind gebrauchsfertige konzentrierte Stammlösungen von Proteaseinhibitoren zur Zugabe zu Proben, um den proteolytischen Abbau während der Zelllyse und Proteinextraktion zu verhindern. Einweg-Cocktail (100x).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioReagenz, für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge; 99% (NMR), kristallin</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>Kaliumchlorid, KCl, ist&nbsp; Wird in der Regel in Laborroutinen verwendet. Seine Verwendung als Speicherpuffer für pH-Elektroden und als Referenzlösung für Leitfähigkeitsmessungen ist gut etabliert.</td></tr><tr><td>MCF10 Zelllinie</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&nbsp;</td><td>Epithelzelllinie, die 1984 aus der Brustdrüse einer weißen, 36-jährigen Frau mit fibrozystischen Brüsten isoliert wurde. Diese Zelllinie wurde von der Michigan Cancer Foundation hinterlegt.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>Magnesiumchlorid ist ein farbloser kristalliner Feststoff.</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylen-diamin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>Für die Elektrophorese, ca. 99%</td></tr><tr><td>Phosphat-Kochsalzpuffer 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) ist&nbsp; a gepuffert&nbsp; ausgewogene Salzlösung&nbsp; Wird für eine Vielzahl von biologischen und zellkulturellen Anwendungen verwendet, wie z. B. das Waschen von Zellen vor der Dissoziation, den Transport von Zellen oder Gewebe, das Verdünnen von Zellen für die Zählung und die Vorbereitung von Reagenzien.</td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>Elektronenakzeptor, eingesetzt in Systemen mit Elektronentransport,</td></tr> <tr><td>SDS Lösung 20% (w/v)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>Natriumdodecylsulfat. Reagenz zur Elektrophorese-Reinheit&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat, ReagenzPlus 99%</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>21.726-3</td><td>Natriumthiosulfat, ReagenzPlus 99%</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>Schwefelsäure, Reagenz, ist&nbsp; Eine extrem ätzende Säure, die in einer gelblichen, leicht viskosen Flüssigkeit vorliegt. Es ist wasserlöslich und eine diprotische Säure. Es hat sehr stark korrosive, dehydrierende und oxidierende Eigenschaften und ist hygroskopisch.</td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>Trichloressigsäure (TCA) ist&nbsp; wird als Reagenz für die Fällung von Proteinen1,2 und Nukleinsäuren3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td>Trifluoressigsäure</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100 ist ein nichtionisches Polyoxyethylen-Tensid, das am häufigsten zur Extraktion und Solubilisierung von Proteinen verwendet wird.</td></tr><tr><td>Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Proteomics Grade, BioReagenz, dimethylierter</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>Harnstoff ist ein chaotropes Mittel und wird zur Denaturierung von Proteinen verwendet. Es stört die Wasserstoffbrückenbindungen in der Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen. Es kann auch die Wasserstoffbrückenbindung in der DNA-Sekundärstruktur stören</td></tr></tbody></table>

enthüllung von histon-proteoformen mit 2d-tau-gelelektrophorese

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

In Abbildung 1A ist zu beobachten, wie Histonproteine in einem 1D-Gel wandern. Dies ist ein wichtiger vorbereitender Schritt, um die Laufzeit der ersten Dimension zu verstehen. Sobald der richtige Zeitpunkt für die Trennung bestimmt ist, führen Sie die zweite Dimension aus. Die 2D-Karte der Histon-Proteoformen zeigt ein charakteristisches topographisches Muster (Abbildung 1B). Jeder Punkt in Abbildung 1B stellt einen bestimmten Histontyp dar. Beobachten Sie die genaue Region des Gels, in der sich jedes Histon-Proteoform befindet. Die massenspektrometrische Identifizierung für jedes Histon-Proteoform wird in Perri et al.32 beschrieben. Daher ist jeder Punkt in diesem Zustand mit einem bestimmten Histontyp verbunden. Das Vorhandensein zusätzlicher Flecken neben den kanonischen Flecken könnte auf das Vorhandensein neuer Modifikationen hinweisen. Gelbilder können mit Hilfe der Densitometrie aufgenommen werden, und das resultierende Bild kann mit einer Bildanalysesoftware analysiert werden.
Die Zuverlässigkeit der 2D-TAU-Karte hängt von der Rundheit des Spots ab. Wenn der Lauf korrekt durchgeführt wurde, erscheinen die Flecken als deutliche Signale und es sind keine horizontalen und vertikalen Streifen sichtbar. Umgekehrt können Verunreinigungen in der Probe, den Lösungen und der Agarose-Überlagerung Schlieren und/oder Streifen im Gel verursachen. Die Qualität des Gels wirkt sich auf die Bilddigitalisierung und die anschließende quantitative und qualitative Analyse aus. Darüber hinaus könnte es den Erfolg der Western-Blot-Analyse und der MS-Untersuchung beeinflussen. Um die Zuverlässigkeit der Methode zu überprüfen, untersuchten wir die Nitrozellulosemembran von aufgelösten Histon-Proteoformen mit dem primären Antikörper Acetyliertes Lysin (Ac-K2-100) KaninchenmAb 32 (Abbildung 2). Ein Anti-Kaninchen-HRP-Sekundärantikörper wurde zum Nachweis von Histonsignalen verwendet. Wie erwartet, ist es mit einem Densitometer möglich, die eigentümliche posttranslationale Modifikation jeder im Blot vorhandenen Histonvariante zu quantifizieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg"> 
Abbildung 1: 1D- und 2D-TAUgel. (A) Repräsentatives Bild des topographischen Histonenmusters, das mit 1D-TAUgel aufgenommen wurde. (B) Repräsentatives Bild eines topographischen Histonenmusters, das mit 2D-TAUgel aufgenommen wurde. Datenidentifikationen werden von Perri et al. berichtet 32. Wie erwartet, repräsentiert jeder Fleck ein spezifisches Histon-Proteoform. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Repräsentativer 2DTAU Western Blot. Im Bild ist es möglich, den Grad der Lysinacetylierung in jedem Histon-Proteoform zu beobachten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenzien</td>
			<td>Konzentration: 15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamid/Bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 M Tris pH 8,8</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Wasser</td>
			<td>3,6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Sicherheitsdatenblatt</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Zusammensetzung der Gellösung auflösen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schritt</td>
			<td>Zeit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixierung von 50 % Methanol / 5 % Essigsäure</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Ethanol waschen</td>
			<td>2 x 20 Minuten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waschen Sie deionisiertes Wasser</td>
			<td>1 x 20 Minuten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sensibilisator Thiosulfat Reagenz</td>
			<td>ca. 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waschen Sie deionisiertes Wasser</td>
			<td>3 x 20 Sek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silber Silbernitrat</td>
			<td>30 Minuten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waschen Sie deionisiertes Wasser</td>
			<td>3 x 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entwicklungsentwickler</td>
			<td>ca. 25-30 min Hinweis: Entwickeln Sie das Gel, bis die Flecken sichtbar sind (hellbraun)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopp-Lösung</td>
			<td>1 x 10 Minuten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waschen Sie deionisiertes Wasser</td>
			<td>2 x 5 Minuten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waschen Sie deionisiertes Wasser</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Methode der Silberfärbung.

Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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Phosphatase-Assay in Darmkrebszellen: Eine Methode zur Untersuchung des Phosphorylierungsstatus des Tau-Proteins in Darmkrebszellen

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Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

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