Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse

Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der Entwicklung natürlicher reaktiver Verbindungen. Mit einer In-vitro-Methode wollen wir daher die Aktivität der Elastase bewerten, eines Enzyms, das am Abbau von Elastin und dem Verlust der Elastizität beteiligt ist, um die Homöostase des Gewebes wiederherzustellen. Die Quantifizierung natürlicher Pflanzenextrakte, die Aktivität, stellt mehrere Herausforderungen dar, die hauptsächlich mit ihrer komplexen chemischen Zusammensetzung und ihrer oft starken Färbung zusammenhängen, die gängige Messungen beeinträchtigen kann.

Die Entwicklung zuverlässiger adaptiver Protokolle ist für die Weiterentwicklung dieses Forschungsfeldes von entscheidender Bedeutung. Unsere Studie bietet mehrere Vorteile für die Felder, darunter Einfachheit, Sensitivität, schnelles Spannungsergebnis und Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Forschungsanforderungen. Wiegen Sie zunächst die entsprechende Menge an Tris-Base mit einer Analysenwaage und geben Sie die gewogene Tris-Base in ein Becherglas.

Geben Sie mit einem Messzylinder entionisiertes Wasser in das Becherglas. Rühren Sie die Lösung mit einem Magnetrührer um, bis sich die Tris-Basis vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie dann den pH-Wert der Lösung mit vier normalen Salzsäure auf acht ein.

Sobald der gewünschte pH-Wert erreicht ist, wird die Lösung in einen Messkolben überführt. Füllen Sie den Kolben mit entionisiertem Wasser bis zum markierten Volumen. Füllen Sie den vorbereiteten Puffer in eine beschriftete Vorratsflasche um und lagern Sie ihn bei Raumtemperatur.

Wiegen Sie für die Probenvorbereitung die erforderliche Probenmenge mit einer Analysenwaage genau. Die Probe wird in dem vorbereiteten Reaktionspuffer aufgelöst, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Verwenden Sie einen Vortex-Mischer, um die Probe vollständig aufzulösen.

Und lagern Sie die vorbereitete Probe auf Eis. Als nächstes bereiten Sie eine Arbeitslösung des Elastase-Enzyms in Reaktionspuffer auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter vor. Lagern Sie die Elastaselösung bis zur Verwendung auf Eis.

Bereiten Sie nun eine 0,8 millimolare SANA-Lösung in Reaktionspuffer vor. Schützen Sie die Lösung vor Licht und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Für das Phenylmethansulfonylfluorid oder PMSF-Stamm ist eine 100 Millimolare PMSF-Lösung in Isopropanol herzustellen.

Lagern Sie die vorbereitete Lösung auf Eis. Bereiten Sie alle Reaktionen in dreifacher Ausfertigung mit Mikrozentrifugenröhrchen vor. Inkubieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie dann 100 Mikroliter der SANA-Substratlösung in jedes Röhrchen, mit Ausnahme der Farbsteuerung. Drehen Sie die Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um die Proben zu mischen, und übertragen Sie 300 Mikroliter aus jedem Röhrchen auf eine 96-Well-Platte, um dreifache Messungen für jede Probe zu gewährleisten. Setzen Sie schließlich die 96-Well-Platte in ein Mikroplatten-Reader mit einer Größe von 410 Nanometern ein und messen Sie die Absorption regelmäßig, jede Minute für 20 Minuten oder bis sich das Signal bei Raumtemperatur stabilisiert hat.

Extrakt eins zeigte eine schwache, aber signifikante Elastase-Hemmaktivität bei Konzentrationen von eins, 0,75 und 0,5 Milligramm pro Milliliter, ohne signifikante Wirkung bei 0,25 Milligramm pro Milliliter. Extrakt zwei zeigte bei allen getesteten Konzentrationen eine hohe Elastase-Hemmwirkung, mit ähnlichen Hemmwerten wie bei der Positivkontrolle bei einem, 0,75 und 0,5 Milligramm pro Milliliter.