Intravitale longitudinale Bildgebung der Gefäßdynamik im Schädeldachknochenmark

Diese Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der Gefäßdynamik in der Makroumgebung des Knochenmarks mit Hilfe der Intravitalmikroskopie, um aufzuzeigen, wie Blutgefäße auf normale und pathologische Hämatopoese reagieren. Wir verwenden fortschrittliche Bildgebungstechnologien wie die Photomikroskopie, transgene Tiermodelle und analysieren einen Tracer, um dynamische Gefäßveränderungen in lebendem Gewebe im Laufe der Zeit zu visualisieren und zu quantifizieren. Der wichtigste Fortschritt ist die Verfeinerung unseres Protokolls, um den Tierschutz zu verbessern und die drei Rs zu erfüllen. Unser longitudinaler Ansatz minimiert die chirurgischen Schritte und reduziert die Anzahl der für unsere Studie benötigten Tiere erheblich.

Unser Protokoll erfüllt den Bedarf an ungiftiger, intravitaler Langzeitbildgebung durch die Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops, das eine tiefe Gewebepenetration und eine hochauflösende Visualisierung des Zellverhaltens und der Zellinteraktion ermöglicht. Die Verwendung des 3D-gedruckten Kopfimplantats macht es sehr einfach, den interessierenden Bereich während der Längsbildgebung zu finden, ohne die Höhe, den Winkel oder die Reihenfolge ändern zu müssen. Wir verwenden dieses Protokoll derzeit, um spezifische endotheliale Subtypen und ihr Ansprechen auf die Entwicklung von Leukämie und die medikamentöse Behandlung zu verfolgen, um ihren Beitrag zur Krankheitspathogenese besser zu verstehen.

Starten Sie zunächst die Segmentierungssoftware und importieren Sie die Mikro-CT-DICOM-Dateien, um den Schädel zu isolieren. Führen Sie eine schwellenwertbasierte Segmentierung durch, um das Knochengewebe von den umgebenden Strukturen zu trennen. Passen Sie komplexe oder verrauschte Bereiche manuell an, um die Segmentierung zu verfeinern.

Importieren Sie in 3D Slicer die DICOM-Dateien und laden Sie den Datensatz. Beobachten Sie die CT-Schnitte in der axialen, sagittalen und koronalen Schnittansicht. Öffnen Sie den Segmenteditor und klicken Sie auf Hinzufügen, um eine neue Segmentierung zu erstellen, und klicken Sie dann erneut auf Hinzufügen, um ein neues Segment für die Schwellenwertbestimmung zu erstellen.

Klicken Sie im Segment-Editor-Panel auf den Schwellenwerteffekt. Passen Sie den unteren und oberen Schwellenwertregler an oder geben Sie numerische Werte ein, um den segmentierten Bereich rot hervorzuheben. Um den segmentierten Schädel als stl-Datei zu exportieren, wechseln Sie zum Segmentierungsmodul.

Stellen Sie sicher, dass das Segment mit Schwellenwert ausgewählt ist. Legen Sie im Abschnitt Modelle und Beschriftungskarten exportieren/importieren den Exporttyp auf Modelle und das Dateiformat auf stl fest, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die Datei zu speichern. Für die Aufbereitung des Schädelmodells im CAD importieren Sie zunächst das vereinfachte Schädelmodell im stl-Format als neues Bauteil oder Modell in die CAD-Software.

Erstellen Sie in der Medianebene eine Achse, die tangential zur Schädelvaria verläuft, und speichern Sie dann das vorbereitete Schädelmodell. Erstellen Sie eine Skizze in der Schädelbahn, und entwerfen Sie einen birnenförmigen Spline von AP plus 6,5 bis minus zwei. Mit einer Breite von sechs Millimetern bei AP 0,0 wird dies die beobachtbare Oberflächenkontur sein.

Gestalten Sie den Schwanz des Implantats so, dass er sich an die Schädelstruktur anpasst, um eine korrekte Fixierung zu gewährleisten und gleichzeitig das verfügbare Volumen zu berücksichtigen. Erstellen Sie abschließend eine Schutzabdeckung, um das Beobachtungsfenster bei Nichtgebrauch zu schützen. Legen Sie eine betäubte Maus auf ein auf 37 Grad Celsius eingestelltes Heizkissen und überwachen Sie visuell die Atemfrequenz.

Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einem Elektrorasierer. Tragen Sie dann einen Tropfen Augengel auf die Augen der Maus auf. Stellen Sie sicher, dass alle Haare entfernt werden, um bildgebende Artefakte zu vermeiden und das Risiko einer Wundinfektion zu verringern.

Verwenden Sie nun eine sterile Pinzette und eine Schere, um einen kleinen Schnitt im zentralen Teil der Kopfhaut zu machen, um die zentrale Knochennarbe freizulegen. Entfernen Sie das Bindegewebe zwischen dem Schädel und der Kopfhaut. Mischen Sie ausreichend Zahnzement in einer Petrischale, um eine Paste herzustellen.

Tragen Sie es schnell auf die Unterseite des Kopffixationsimplantats auf. Ohne dass Zahnzement in den Bildgebungsbereich gelangt, setzen Sie den Kopfhalter auf den freiliegenden Schädel und lassen Sie ihn aushärten. Schalten Sie den Isofluranfluss in Richtung der stereotaktischen Maske des Mikroskops ein.

Bringen Sie nun die Maus schnell ans Mikroskop. Führen Sie die Zähne der Maus vorsichtig in die Maske ein, um eine korrekte Isofluranpenetration zu gewährleisten, indem Sie die Nase mit einer Hand anheben. Während Sie die Maus mit einer Hand halten, schieben Sie mit der anderen Hand den Schwalbenschwanz des Kopffixierungsimplantats vorsichtig in die Fixierhalterung.

Sichern Sie es mit einer halben Umdrehung des Schraubknopfes. Führen Sie als Nächstes eine rektale Sonde ein, die mit einem Gel auf Wasserbasis voreingebettet ist, um die Temperatur der Maus zu überwachen. Füllen Sie die Bildgebungskammer des Kopfes mit einer großen Menge Gel auf Wasserbasis (PBS).

Senken Sie das Wasserimmersionsobjektiv ab, bis es vollständig eingetaucht ist, um eine optimale Anregung und Signaldetektion während der Zwei-Photonen-Anregung zu erzielen. Verschieben Sie den x-, y-Tisch und den z-Antrieb, um sich auf den zentralen Knochen in der Gerüstnarbe zu konzentrieren. Identifizieren Sie das Gewebe, das durch die Knochenoberfläche und die zentrale Vene markiert ist.

Schalten Sie das Licht im Raum aus und schließen Sie die Box um das Mikroskopstativ. Nach Aktivierung der Nicht-TOSCAN-Detektoren. Legen Sie PMT1 so fest, dass das zweite SHG bei 423 bis 461 Nanometern erkannt wird, der hohe D2 für GFP bei 485 bis 548 Nanometern und der hohe D3 für TD D'Amato bei 551 bis 645 Nanometern.

Belassen Sie den Versatz bei Null. Stellen Sie nun die PMT SHG-Verstärkung auf 850 Volt und die hohe D-Verstärkung auf 100 % einErhöhen Sie die Infrarot-Laserleistung, bis auf dem untersten der drei Kanäle ein Bild mit einem Dynamikbereich von 200 Graustufen sichtbar ist. In der Erfassungssoftware wird die Locator-Region, die Knochenmarktaschen enthält, innerhalb der Knochenoberflächen angezeigt.

Um verschiedene Regions of Interest oder ROIs zu identifizieren, aktivieren Sie den Loss Navigator und erstellen Sie eine Übersicht im Spiralmodus. Klicken Sie auf das Einzelbildsymbol, um ausgewählte ROI-Positionen aufzuzeichnen und jede Position in der Aufgabenliste umzubenennen. Um ein Z-Stack-Volumen zu erfassen, wählen Sie den Z-Stack-Modus und definieren Sie die Schrittweite bei drei Mikrometern.

Deaktivieren Sie die Option "Gleiche Stapelgröße für alle Regionen" und drücken Sie dann auf "Anfang", um zu beginnen, und auf "Ende", um zu beenden. Klicken Sie nach der Erfassung auf Stapel neu definieren. Drücken Sie Start, um die Bildsammlung zu starten und die Bilder im entsprechenden Ordner zu speichern.

Um ein dynamisches Merkmal, wie z. B. die Gefäßpermeabilität, zu messen, ändern Sie den Erfassungsmodus in XYZT, um einen Zeitraffer zu erfassen. Stellen Sie im T-Modul das Zeitintervall auf drei Minuten und die Dauer auf eine Stunde ein. Injizieren Sie nun 100 Mikroliter 70 Kilodalton Dextran TRITC intravenös in einer Konzentration von vier Milligramm pro Milliliter und beginnen Sie mit der Erfassung.

Nachdem Sie die Maus auf eine Operationsmarkierung auf einem 37 Grad Celsius heißen Heizkissen übertragen haben, tragen Sie Intrasite-Gel auf den Schädel auf, um ihn mit Feuchtigkeit zu versorgen. Verschließen Sie den bildgebenden Bereich des Kopfimplantats mit der speziellen Abdeckung und befestigen Sie die Abdeckung vorsichtig mit einer Schraube. Setzen Sie die Maus in die auf 37 Grad Celsius eingestellte Heizbox ein und warten Sie, bis sie erwacht.

Sobald sich die Maus vollständig erholt hat, transportieren Sie sie zur Tierhaltung und bringen Sie sie in einem sauberen Käfig mit Hydrogel und Umweltanreicherung unter. Geben Sie für Längsaufnahmen einen kleinen Tropfen ophthalmisches Gel auf die Augen einer Maus, auf der bereits ein Kopfhalter installiert ist. Rufen Sie das Übersichtsbild ab, wie zuvor gezeigt.

Richten Sie bei Bedarf das vorherige und das neue Bild mit dem Modul Bild laden und ausrichten neu aus. Öffnen Sie das Bildschirmaufnahmebild, um Positionen an ihrer ursprünglichen Stelle zu markieren. Das CAD-Modell eines Titan-Kopffixationsimplantats wurde so konzipiert, dass es sich an die anatomische Struktur des Schädels anpasst und eine stabile Befestigung am Mikroskoptisch für die Bildgebung auf zellulärer Ebene gewährleistet.

Das Implantat wurde erfolgreich am Schädel der Maus befestigt und ermöglichte eine stabile Bildgebung über einen längeren Zeitraum, während die Maus ihre normalen Aktivitäten aufrechterhalten konnte. Das Gefäßsystem des kalvarialen Knochenmarks wurde mit Hilfe eines Kachelscans sichtbar gemacht, der ein komplexes Netzwerk aus Arteriolen, Übergangskapillaren und Sinusoiden zeigte. Die quantitative Gefäßanalyse zeigte die Segmentierung von Gefäßstrukturen, die die Messung von Gefäßdurchmesser, -länge und -geradheit sowie deren Korrelation ermöglichte.

Die longitudinale Bildgebung erfasste einen fortschreitenden Umbau der Schädeldachgefäße während des Fortschreitens der Leukämie mit erhöhter Gefäßdichte, die im Laufe der Zeit beobachtet wurde. Die vaskuläre Permeabilität wurde dynamisch bewertet, wobei eine differentielle Retention des Fluoreszenzfarbstoffs über die Zeit und eine differentielle Permeabilität verschiedener Knochenmarkgefäße gezeigt wurde.