Name: Mikrobiota von Attinanameisengärten: Visualisierung einer mikrobiellen Landschaft mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Erfahren Sie, wie die Mikrobiota in Pilzgärten von Attina-Ameisen mit Rasterelektronenmikroskopie untersucht wird. Diese optimierte Methode ermöglicht die Visualisierung von Biofilmen und mikrobiellen Interaktionen.

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<meta charset="utf8"></head><body> Mikroskalige REM-Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften in pilzzüchtenden Ameisenkulturen

Ökosysteme bestehen aus Organismen, die durch Prozesse an einem bestimmten geografischen Ort (d. h. der Umwelt) miteinander verbunden sind. Organismen interagieren im Laufe der Zeit mit ihrer Umwelt, wodurch komplexe und heterogene räumliche Muster entstehen. Räumliche Muster bestimmen die ökologische Vielfalt und Stabilität und letztlich das Funktionieren des Ökosystems 1,2,3,4. In makroskaligen Ökosystemen wie Feuchtgebieten, Savannen, Korallenriffen und trockenen Ökosystemen korrelieren räumliche Muster mit Ressourcenfluss und -konzentration. Durch die Optimierung von Ressourcen führen räumliche Heterogenität und Musterbildung zu widerstandsfähigeren Ökosystemen als homogeneÖkosysteme 2. Die räumliche Lokalisierung von Organismen, die die Grundlage der Ökologie von Lebensgemeinschaften bildet, wird auch auf die mikrobielle Welt übertragen.
Mikrobielle Ökosysteme, weit entfernt von Organismen, die zufällig und homogen in Mikrohabitaten gemischt sind, weisen räumliche Muster auf, die einen Großteil ihrer Funktionsweise bestimmen 5,6,7. Von Winogradsky-Säulen bis hin zu umwelt- und wirtsassoziierten Mikrobiota sind diese Ökosysteme heterogen im Raum organisiert, wobei räumliche Anordnungen unterschiedliche phänotypische Reaktionen hervorrufen. Zusammenlebende Arten interagieren mit größerer Wahrscheinlichkeit und beeinflussen die Physiologie der anderen. So grenzt die räumliche Organisation der Gemeinschaft, mehr als ihre Zusammensetzung an sich, Ökosystemeigenschaften und ökologische Nischenab 5,7,8. Zur Veranschaulichung dieser Konzepte scheinen Veränderungen in der räumlichen Musterung mit dem pathologischen Fortschreiten von Zahnbelag, Karies, Zahnfleischerkrankungen 9,10, entzündlichen Darmerkrankungen11, Mukoviszidose, Lungeninfektionen, chronischen Wundinfektionen12,13, Darmkrebs und Adenomen14 zu korrelieren.
Im Rahmen der mikrobiellen Biogeographie (der Untersuchung der Verteilung und Musterung der biologischen Vielfalt über Raum und Zeit auf einer Mikroskala) ist das Wissen über mikrobielle Ökosysteme durch das Verständnis ihrer räumlichen Muster von großem Nutzen 6,13,15,16,17. Wir haben uns die räumlichen Muster eines von Insekten aufgebauten mikrobiellen Ökosystems angesehen, das sich im Kern der charismatischen pilzzüchtenden Attinameisenkolonien (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina) befindet. Es gibt einen "mikrobiellen Garten", der sich um einen Basidiomyceten-Pilz aus dem Tribus Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) oder aus der Familie der Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales) dreht18,19,20,21,22. Der Garten ist eine schwammige Struktur, die aus einem ineinander verschlungenen Netz von Hyphen entsteht, das durch Verstoffwechselung des meist pflanzlichen Substrats wächst, das von den Ameisen eingebaut wird (Abbildung 1). Dazu können je nach den attinischen Gattungen gehören: trockene Pflanzenteile, Insektenfrasse und -kadaver, frisch geschnittene Blätter, Samen und Blütenteile23,24. Analog zu einem externen pflanzenfressenden Darm wandelt der Garten widerspenstige Polymere enzymatisch und chemisch in labile Nahrungsressourcen um und versorgt die Ameisen mit essentiellen Aminosäuren, Lipiden und löslichen Zuckern 21,25,26,27,28.
Ultrastrukturelle, enzymatische und transkriptomische Analysen, die für Gärten der Blattschneidergattungen Atta und Acromyrmex durchgeführt wurden, deuten darauf hin, dass diese Umgebungen ein Kontinuum von Substratabbau und Nährstoffflecken strukturieren 26,29,30,31,32. Junge Teile des Gartens sind durch das frisch eingearbeitete Substrat nach dem Fragmentieren tendenziell dunkler. Diese neu hinzugekommenen Substrate werden oft von den Rändern aus besiedelt, die von Ameisenarbeitern geschnitten und mit Myzelklumpen beimpft wurden. Pilzhyphen, die von Schnittkanten ausgehen, breiten sich über das Substrataus 29,32,33. Die Hyphenhäufigkeit nimmt mit fortschreitendem Substratabbau zu, was zu weißlichen und stoffwechselaktiven Regionen führt 30,31,32. Ältere Regionen mit stärker abgebautem Substrat und einer reichlich vorhandenen Mikrobiota29,32 neigen zu bräunlichen Tönen und höherer Luftfeuchtigkeit. Die Arbeiter entfernen Fragmente dieser Region und trennen sie in Abfallhaufen, wo sie auch Substrate entnehmen, die dem Pilzsymbionten 34,35,36 schaden. Obwohl Abfallhaufen physisch vom Garten getrennt sind, sind sie ein Ort des kontinuierlichen Substratabbaus und des Nährstoffkreislaufs durch die reichlich vorhandene bewohnte Mikrobiota 29,32,37,38,39.
Eine Mikrobiota, die hauptsächlich aus Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas und Serratia besteht, bewohnt ebenfalls den Garten, die anscheinend von verschiedenen Attine-Pilzzuchtsystemen geteilt wird. Die Mikrobiota kodiert für Stoffwechselwege, die den Pilzstoffwechsel ergänzen könnten, und ist möglicherweise an den physiologischen Reaktionen des Gartens beteiligt 40,41,42,43,44. Metagenomische Daten deuteten nicht nur darauf hin, dass die Mikrobiota vorhanden war41,42, sondern auch die Rasterelektronenmikroskopie (REM) Analyse der Pilzkultur von Blattschneiderameisen zeigte hauptsächlich stäbchenförmige Bakterien über dem Pflanzensubstrat32. Obwohl Bakterien (einschließlich zellulolytischer Stämme) aus dem gesamten Garten isoliert wurden, wurden sie nur in älteren Teilen des Gartens und in Abfallhaufen sowie in dem ersten Pellet sichtbar, das von den Gründerköniginnengetragen wurde 29,32. Es war auch unsicher, ob die Mikrobiota in vivo (d. h. im Garten und im Abfall) Biofilme bilden kann, wie ihre metabolische Kapazitätvermuten lässt 42 und in vitrobeobachtet wurde 44.
Hier haben wir SEM eingesetzt, um die räumliche Organisation der Mikrobiota in den Gartenregionen weiter zu verstehen, indem wir die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Mikrobiota-Substrat und Mikrobiota-Hyphen detailliert beschrieben haben. Durch die Bereitstellung von Bildern mit größerer Brenntiefe ermöglicht das REM die Beobachtung dreidimensionaler mikroskopischer Strukturen in hoher Auflösung und ermöglicht so eine gründliche Analyse der räumlichen Muster der Gartenmikrobiota. Wir beschreiben die Schritte zum Fixieren, Dehydrieren, Trocknen, Sputtern, Beschichten und Abbilden solcher heterogenen und empfindlichen Proben auf Pilzbasis. Durch den Wegfall des Postfixationsschritts mit Osmiumtetroxid (OsO4) und die Verkürzung der Dehydratisierungszeit haben wir die Protokolle 32,33,45 für die Vorbereitung von Garten- und Abfallproben für die REM-Analyse vereinfacht. Dieses angepasste Protokoll bewahrt die Hyphenstrukturmuster sowie die räumliche Organisation der Mikrobiota und des Biofilms und könnte auf andere empfindliche mikrobielle Ökosysteme und Biofilme angewendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig01v2.jpg"> 
Abbildung 1: Mikrobielle Gärten von Atti. Der Garten ist eine schwammartige Struktur, die aus einem ineinander verschlungenen Geflecht von Hyphen entsteht, das durch Verstoffwechselung des meist pflanzlichen Substrats wächst, das von den Ameisen eingebaut wird. Ebenfalls im Garten wohnt die Mikrobiota, die Stoffwechselwege kodiert, die den Stoffwechsel der Pilze ergänzen könnten. Metagenomische Daten und frühere Rasterelektronenmikroskopie-Analysen deuteten auf sein Vorhandensein hin, obwohl wir nur wenige Kenntnisse über seine räumliche Organisation und seine physikalischen Wechselwirkungen mit dem Substrat und den Pilzhyphen hatten. Wir setzten SEM ein, um die räumliche Organisation und Musterung der Mikrobiota und des Biofilms zu enthüllen. Illustrationen von Mariana Barcoto (Garten und Mikrobiota adaptiert von Barcoto und Rodrigues 94) und Fotos von Mariana Barcoto und Enzo Sorrentino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>2-ml-Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-BRA</td><td>Zur Fixierung und Dehydrierung von</td></tr><tr><td>Proben Calciumchlorid wasserfrei</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>CaCl2 wasserfrei zur Herstellung von Karnovsky" s Fixiermittel</td></tr><tr><td>Trockner für kritische Punkte</td><td>Leica</td><td>EM CPD 300</td><td>Für die Trocknung von kritischen Punkten</td></tr><tr><td>Doppelseitiges leitfähiges Klebeband, 12 mm (B) X 5 M (L)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>77819-12</td><td>Für die Aufnahme</td></tr><tr><td>von Proben Entomologische Pinzette</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Für die Manipulation von Gartenproben</td></tr><tr><td>Ethylalkohol (=Ethanol), rein (&ge; 99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>Für die Dehydrierung</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Für die Manipulation von Gartenproben</td></tr><tr><td></td><td>Glasbecher Kein spezieller Lieferant</td><td></td><td>Für die Dehydrierung</td></tr><tr><td>Glas-Petrischale</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Für die Manipulation von Gartenproben</td></tr><tr><td>Glaspipette</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Für die Fixierung und Dehydrierung von Proben</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (wässriger Glutaraldehyd EM Grade 25%)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16220</td><td>Zur Herstellung von Karnovsky' s fixierendes</td></tr><tr><td>Gold-Ziel&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>8071</td><td>Sputtern, Überziehen mit</td></tr><tr><td>Goldsalzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Zum Anpassen von Lösungen pH</td></tr><tr><td>Bildbearbeitungsprogramm</td><td>Photoshop</td><td>beliebige Version</td><td>Zum Anpassen von Bildern</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (Paraformaldehyd 20% wässrige Lösung EM Grade)</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>15713</td><td>Zur Vorbereitung von Karnovsky' s Fixiermittel</td></tr><tr><td>Propilen-Empfänger</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Für die Erhaltung lebender Ameisenkolonien</td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>IT300 REM</td><td>Für die Probenbildgebung</td></tr><tr><td>Natriumcacodylat-Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Zur Herstellung von Natriumcacodylat-Puffer</td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Kein spezifischer Lieferant</td><td></td><td>Zur Manipulation von Gartenproben</td></tr><tr><td>Probenbehälter mit 15 mm Durchmesser x 10 mm Höhe</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>Für die Trocknung kritischer Punkte</td></tr><tr><td>Sputter-Coater</td><td>Baltec</td><td>SCD 050</td><td>Zum Beschichten mit goldenem</td></tr><tr><td>Stummel (Aluminiumaufnahme, flacher Endstift) 12,7 mm x 8 mm;</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>75520</td><td>Zum Einbetten von Proben</td></tr></tbody></table>

mikrobiota von attinanameisengärten: visualisierung einer mikrobiellen landschaft mit hilfe der rasterelektronenmikroskopie

Microbiota of Attine Ants' Gardens: Visualizing a Microbial Landscape by Scanning Electron Microscopy

Hier haben wir ein vereinfachtes Protokoll vorgestellt, um die Bestandteile von Attingarten- und Abfallproben, wie Pilzhyphen, Substrat, Mikrobiota und Biofilme, zu visualisieren. SEM hat unser Verständnis dafür verbessert, wie der Garten und der Abfall die Strukturmuster der Mikrobiota bilden (Abbildung 3). In Attingärten sind Pilzhyphen astartige Strukturen, die Teile der Substratoberfläche bedecken. Da Pilzhyphen dazu neigen, sehr empfindlich auf Dehydrierung und Bruch zu reagieren, kann sich der Benutzer bei der Bewertung der Ergebnisse der Probenvorbereitung von dem Hyphenaspekt leiten lassen. Wie auch in früheren Arbeiten 32,33,45 beobachtet, weisen Hyphen ein röhrenförmiges Aussehen auf; intakte, röhrenförmige Hyphen deuten auf eine effektive Probenvorbereitung hin (Abbildung 3A und Abbildung 4C). Wenn Hyphen bandförmig sind, ist eine solche Abflachung möglicherweise ein Artefakt der Technik (Abbildung 4C).
Pflanzensubstratoberflächen sind an der Kutikula und den Epidermisschichten sowie an den Spaltöffnungen und Trichomen zu erkennen. Solche Strukturen sind besser erkennbar, wenn die Substrate noch nicht von den Pilzhyphen und der Mikrobiota besiedelt sind (Abbildung 3A und Abbildung 4C). Wenn das Substrat besiedelt ist, bedecken die Mikrobiota und/oder Pilzhyphen seine Oberfläche, so dass bestimmte Pflanzenstrukturen nicht ohne weiteres erkennbar sind (Abbildung 3A). Die Mikrobiota kann entweder die Pilzhyphen oder das Substrat besiedeln, wobei jede von ihnen in scheinbar unterschiedlicher räumlicher Organisation ist. In Abbildung 3 wurden solche räumlichen Muster schematisch dargestellt und in den jeweiligen REM-Bildern eingerahmt, wo sie identifiziert wurden; Dies kann die Verbindung zwischen REM-Ergebnissen und ihrer Interpretation erleichtern.
Hyphen-besiedelnde Mikrobiota werden seltener beobachtet und bestehen, wenn sie gefunden werden, aus Stäbchen- oder Kokzoidzellen, die isoliert oder in kleinen Gruppen an der Hyphenoberfläche befestigt vorkommen. Die exopolysaccharidische Biofilm-Matrix (EPS), die wie eine "Spitzengewebe"-Struktur aussieht, kann in kleinen Klumpen beobachtet werden, die Hyphen umgeben (Abbildung 3A). Ziemlich häufiger ist die substratbesiedelnde Mikrobiota, die in Gärten verschiedener Attinameisenarten zu finden ist. Die Besiedlungsmuster scheinen bis zu einem gewissen Grad durch die Stadien der Substratverschlechterung definiert zu sein. Während die Mikrobiota also Substrate besiedelt, die nicht abgebaut werden, kann sie entweder als einzelne Zellen auftreten oder sich in kleinen Gruppen ansammeln. Die Mikrobiota kann das Substrat schichten, wenn es mikroskopische Anzeichen einer Verschlechterung aufweist (d. h. wenn die Kutikular-/Epidermisschichten der Pflanzen und andere Pflanzenstrukturen nicht erkennbar sind und Furchen und Vertiefungen reichlich vorhanden sind).
In diesen "mikrobiellen Matten" ist die Morphologie der Zellen besser erkennbar, wenn die EPS-Matrix nicht vorhanden ist. In Fällen, in denen mikrobielle Zellen in die EPS-Matrix eingebettet sind, ist ihre Morphologie nicht leicht zu unterscheiden. Entsprechend ihrer räumlichen Organisation charakterisierten wir die Biofilme als "gespreizt" oder als "3-dimensional". Wenn der Biofilm ausgebreitet wird, bedecken mikrobielle Zellen und die EPS-Matrix intermittierend die Substratoberfläche und bilden eine flache, 1-3 Zellen dicke Schicht (Abbildung 3B). Wenn der Biofilm 3-dimensional ist, türmen sich mikrobielle Zellen und die EPS-Matrix auf und bilden Cluster mit mehreren Zelldicken. Gartenregionen, die aus verschlechterten Substraten bestehen (z. B. alter Garten und Abfall), beherbergen die Mikrobiota in ihren Furchen und Vertiefungen, wo sie dichte Gemeinschaften bilden (Abbildung 3C). Insbesondere die stark degradierten Substrate in den Abfallproben beherbergen eine üppige Mikrobiota, die morphologisch vielfältigste aller Regionen. Hefen verleihen dieser Gemeinschaft mehr Komplexität, indem sie über einen Biofilm physisch mit den Prokaryoten interagieren. In Abfallproben von Atta sexdens und Acromyrmex sp. wurde beobachtet, dass die EPS-Matrices ein auffälliges fibrilläres Geflecht bildeten, das stäbchenförmige und kokkoide Prokaryoten sowie fusiforme und kugelförmige Hefen umgab (Abbildung 3C).
Die schwammige Struktur des Gartens, die aus einem ineinander verschlungenen Netz von Hyphen resultiert, erfordert zusätzliches Sputtern, um die Probe gleichmäßiger zu beschichten. Solche Schritte vermeiden die Elektronenstreuung, die das Bild verzerrt und seine Auflösung beeinträchtigt (Abbildung 4A). In den Schritten der Probenvorbereitung wurde der größte Teil der Gartenstruktur erhalten und die räumliche Verteilung und Organisation der Mikrobiota enthüllt. Es ist jedoch erwähnenswert, dass Strukturen wie Pilzhyphen und EPS-Matrix sehr empfindlich auf Dehydration reagieren und sehr schwer zu konservieren sind, insbesondere für REM. Die Hyphenstruktur war relativ gut erhalten, dennoch ist davon auszugehen, dass dem Biofilm, der in einigen Gartenproben sichtbar gemacht wurde, einige strukturelle Bestandteile der EPS-Matrix fehlen könnten. Obwohl die glatte äußerste Schicht der Polysaccharide, die die Mikrobiota umschließt, in einigen Proben erhalten blieb (Abbildung 3A, B), wiesen einige von ihnen morphologische Merkmale der Mikrobiota auf, aber keine EPS-Matrix. Es ist jedoch nicht klar, ob die EPS-Matrix tatsächlich nicht vorhanden war oder ob sie während der Probenvorbereitung entfernt wurde.
Einerseits beeinträchtigt das Entfernen der Biofilm-Glattschicht das Verständnis für die genaue Biofilmstruktur. Auf der anderen Seite enthüllt es die Morphologie, die räumliche Organisation und die physikalischen Wechselwirkungen von Zellen, die unter der Schicht leben, was unser Hauptforschungsschwerpunkt ist. Frühere Studien berichteten über die Konservierung sowohl der Pilzhyphen als auch der Biofilmmatrix durch die Verwendung von Osmiumtetroxid (OsO4)-Dampf als primäres Fixiermittel 44,50,51,52,53,54. Dann führten wir ein vergleichendes Experiment durch, bei dem frische Gartenproben mit OsO4-Dampf fixiert wurden, wodurch anscheinend das glatte Aussehen von Biofilmen erhalten blieb (Abbildung 4B). Diese Methode führte jedoch zu einer weitgehenden Abflachung der Hyphen und Mikrobiota. Diese Abflachung führte zum Verlust allgemeiner räumlicher Aspekte des Gartens, wie zuvor beschrieben 29,33,32,45, was weitere Untersuchungen zu gartenstrukturellen Mustern einschränkte. Die Fixierung mit OsO4 erschwerte sowohl die Unterscheidung der mikrobiellen Morphologie und Verteilung als auch die Unterscheidung von Zellstrukturen von technischen Artefakten, was die Interpretation der Daten erschwerte.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig03v2.jpg"> 
Abbildung 3: Architektonische Muster der Mikrobiota. Die Mikrobiota besiedelt entweder die Pilzhyphen und das Substrat in unterschiedlicher räumlicher Organisation. Solche räumlichen Muster wurden schematisch dargestellt und in den jeweiligen REM-Bildern eingerahmt, wo sie identifiziert wurden (in der Abbildung durch weiße Quadrate begrenzt): (A) Hyphen-besiedelnde Mikrobiota bestehen aus isolierten oder kleinen Gruppen von Zellen, wobei in einigen Proben eine exopolysaccharidische Biofilmmatrix nachweisbar ist. (B) Substratbesiedelnde Mikrobiota breitet sich über das gesamte Substrat aus, wobei die EPS-Matrix die Zellen so bedeckt, dass ihre Morphologie nicht leicht zu unterscheiden ist. (C) Substratbesiedelnde Mikrobiota, die 3-dimensionale Gruppen bilden, die mono- oder multimorphologische Biofilme bilden, die in einigen Fällen die EPS-Matrix belegen. Illustrationen von Mariana Barcoto. Abkürzung: EPS = exopolysaccharidische Matrix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig03largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig04v2.jpg"> 
Abbildung 4: Fruchtlose Bildgebung. Bilder von geringer Qualität, die zu ineffektiven Ergebnissen führen und/oder die Interpretation von Architekturmustern behindern. (A) Die Elektronenstreuung verzerrt das Bild und behindert seine Auflösung und damit die Identifizierung der Morphologie. Dies wurde häufig bei Proben beobachtet, die nur einmal gesputtert wurden, und wurde durch zusätzliche Beschichtung reduziert. (B) Das Fixieren frischer Gartenproben mit Osmiumtetroxid (OsO 4)-Dampf als primärem Fixiermittel 44,50,51,52,53,54 bewahrte offensichtlich das glatte Aussehen von Biofilmen. Es führte jedoch zu einer großflächigen Abflachung von Hyphen und Mikrobiota, wodurch die architektonischen Muster des Gartens beschädigt wurden. (C) Die Probenvorbereitung mit Karnovskys Fixiermittel lieferte im Vergleich zu Präparationen mitOsO 4 qualitativ hochwertigere Bilder, wobei der größte Teil der Hyphenstruktur, der Mikrobiota-Verteilung und der räumlichen Muster der Gärten erhalten blieb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Mikrobiota von Attinanameisengärten: Visualisierung einer mikrobiellen Landschaft mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie

In macroscale ecosystems, such as rainforests or coral reefs, the spatial localization of organisms is the basis of our understanding of community ...

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