Screening und Isolierung von C-Glykosid-spaltenden Darmbakterien

Der Umfang unserer Forschung ist der mikrovirale Test für die Medizin. Wir versuchen, eine effektive SOP für das Screening und die Isolierung von Darmbakterien zu etablieren. Bisher wurden insgesamt 18 Bakterienstämme mit Glycinfunktion gefunden.

Der Vorteil unseres Protokolls ist die Verwendung eines kohlenstoffarmen Ausgangsmediums, um die bakterielle Aktivität zu induzieren und somit die Erfolgsrate des Screenings zu erhöhen. Bereiten Sie zunächst die Lösungen A, B und C separat mit den entsprechenden Reagenzien vor. Mischen Sie alle drei Lösungen in einem 1.000-Milliliter-Erlenmeyerkolben und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1.000 Millilitern zu erhalten.

Stellen Sie dann den pH-Wert mit einer 10%igen Natronlauge auf 7,2 ein. Das Medium in 250 Milliliter Erlenmeyerkolben verteilen. Geben Sie dann eine bis 2%ige Schnecke zum allgemeinen anaeroben Medium in einen von 250 Milliliter Erlenmeyerkolben

Autoklavieren Sie das Medium bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten. Nachdem das Medium auf Raumtemperatur abgekühlt ist, lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie auf ähnliche Weise ein kohlenstoffarmes Ausgangsmedium vor, aber lassen Sie Hefeextrakt, Glukose und lösliche Stärke weg.

Für die Referenzlösungen wiegen Sie jeweils fünf Milligramm Orientin und Luteolin. Lösen Sie sie getrennt in einem Milliliter Dimethylsulfoxid auf, um eine Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Bereiten Sie zunächst alle erforderlichen Medien und Reagenzien für den Eingriff vor.

Sammeln Sie ein bis zwei Gramm frischen menschlichen Kot in einem sterilen Einweg-Stuhlsammelröhrchen, das mit Stickstoffgas gefüllt ist. Geben Sie fünf Milliliter allgemeines anaerobes Medium in die Tube. Verschließen Sie das Röhrchen gründlich und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem sterilen anaeroben Inkubator.

Nach 24 Stunden werden 0,5 Milliliter der menschlichen Darmbakteriensuspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das 4,5 Milliliter frisches GAM enthält. Verschließen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter anaeroben Bedingungen, um eine aktive gemischte menschliche Darmflora zu erhalten. Als nächstes mischten wir 260 Mikroliter aktivierte Darmflora mit sechs Millilitern frischem kohlenstoffarmem Quellmedium, das 40 Mikroliter Orientierungsreferenzlösung enthielt.

Inkubieren Sie das beimpfte Medium bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie zusätzlich zum Beispiel ein Steuerelement und eine leere Gruppe hinzu. Nach 24 Stunden und 48 Stunden pipettieren Sie einen Milliliter der Reaktionslösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Das Röhrchen wird bei 13.400 g 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um Bakterien zu entfernen. Geben Sie 200 Mikroliter des Überstands zu 600 Mikrolitern Methanol. Mischen Sie gründlich und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 13.400 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um Proteine zu entfernen.

Filtern Sie nun den Überstand mit einer 0,22 Mikrometer großen mikroporösen Membran. Analysieren Sie das Filtrat mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Verwenden Sie Acetonnitrol als mobile Phase A und 0,1 % Ameisensäure in gereinigtem Wasser als mobile Phase B. Halten Sie die Temperatur der Säule während der HPLC-Analyse auf 40 Grad Celsius und stellen Sie die Durchflussrate auf einen Milliliter pro Minute ein.

Um einzelne Stämme zu isolieren, aktivieren Sie die gemischte menschliche Darmbakterienflora, die in der Lage ist, Orientin zu spalten, wie zuvor beschrieben. Erhitzen Sie den festen GAM, um ihn aufzulösen, und gießen Sie ihn in sterile Einweg-Petrischalen in einem anaeroben Inkubator. Lassen Sie das Medium erstarren, um feste GAM-Platten zu erhalten.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter der aktivierten Bakterienlösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter normale Kochsalzlösung enthält. Impfen Sie eine angemessene Menge der Bakterienlösung mit einem Einweg-Impfring auf eine Petrischale. Verschließen Sie die Schale und inkubieren Sie sie in einem anaeroben Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Beobachten Sie nach 48 Stunden Inkubation die Größe, Morphologie und Farbe der Kolonien auf der Platte. Wählen Sie unterschiedliche einzelne Bakterienkolonien aus und kultivieren Sie sie in 10-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, die 4,5 Milliliter frisches GAM enthalten. Inkubieren Sie unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden, um einzelne Stämme zu erhalten.

Überprüfen Sie die Aktivität einzelner Stämme wie zuvor beschrieben, und führen Sie eine Aktivitätsüberprüfung mit HPLC durch. Eine von 10 Stuhlproben zeigte die Fähigkeit, Orientin während der Transformationsexperimente zu deglykosylieren, was die Machbarkeit des Screenings für aktive Proben bestätigt.