Flowzytometrie-Analyse der Gewebefaktor-Expression bei menschlichen Thrombozyten

In diesem Protokoll schlagen wir ein Schritt-für-Schritt-Tutorial für die Messung des Thrombozyten-assoziierten Gewebefaktors durch Vollblut-Durchflusszytometrie vor, die Beurteilung des Proteins im intrazellulären Kompartiment, bei Arrestbedingungen und auf der Zelloberfläche, sowohl im Ruhezustand als auch bei der Aktivierung. Bei einer DP wird einer der häufigsten Thrombozytenagonisten-Gewebsfaktoren durch eine Untergruppe von Blutplättchen exprimiert. Wenn Gewebefaktor-positive Thrombozyten in plättchenreichem PRP-Plasma oder in gewaschenen Thrombozyten gemessen werden, kann diese Untergruppe während der Probenvorbereitung verloren gehen. Dieses Risiko tritt nicht auf, wenn diese Bewertung in der Wand durchgeführt wird.

Der Blutplättchen-assoziierte Gewebefaktor ist seit dem ersten Bericht, der zu Beginn des Jahrhunderts veröffentlicht wurde, aufgrund von voranalytischen und methodischen Problemen umstritten. Dieses Protokoll wirft Licht auf diese Fragen und wird auch für die Durchführung eines internationalen Projekts verwendet, das von der International Society of Thrombosis and Hemostasis ISDH unterstützt wird, um die Messung des thrombozytenassoziierten Gewebefaktors zu standardisieren, oder die Blutdurchflusszytometrie wird an einigen Mikrolitern Blut durchgeführt, um eine thrombozytenassoziierte Gewebefaktoranalyse zu ermöglichen, die im klinischen Umfeld geeignet ist. Darüber hinaus macht die Möglichkeit, die Probe zu fixieren und anschließend zu markieren, diese Analyse für viele Krankenhäuser und Labore machbar.

Bereiten Sie zunächst ein Reagenzglas für jedes Antikörpervolumen vor. Geben Sie zum Testen einen Tropfen negative Kügelchen und einen Tropfen positive Kügelchen in jedes Reagenzglas. Geben Sie 20 Mikroliter jeder Antikörperverdünnung in das Reagenzglas und den Vortex.

Inkubieren Sie die Reagenzgläser sofort im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Geben Sie dann einen Milliliter PBS ohne Kalzium und Magnesium pH 7,4 in jedes Röhrchen und jeden Strudel, invertieren Sie den Natriumcitrat-Vacutainer fünfmal, um das Blut und das Antikoagulans gründlich zu mischen. Füllen Sie 50 Mikroliter Blut in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie dann 950 Mikroliter 1%Paraformaldehyd hinzu. Mischen Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nun wird die Probe bei 1.500 g fünf Minuten lang mit einer Pause bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Nach Entfernen des Überstands Reese suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS ohne Calcium und Magnesium. Bei einem pH-Wert von 7,4 geben Sie 100 Mikroliter fixiertes Blut in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 1.500 g. Mit Pause bei Raumtemperatur dann den Überstand entfernen.

Suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern 0,1 % Triton PBS, um die Proben zu permatieren, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie zunächst ein Röhrchen für die Fluoreszenz minus eine Kontrolle und ein Röhrchen für die Färbung des Gewebefaktors vor. Geben Sie Antikörper zu 100 Mikrolitern fixiertem und permiertem Vollblut in jedem Röhrchen.

Geben Sie 300 Mikroliter PBS ohne Calcium und Magnesium bei einem pH-Wert von 7,4 in jedes Röhrchen und mischen Sie. Lagern Sie dann die gefärbten Proben im Dunkeln, bis die Durchflusszytometrie-Analyse alpha CD 1 42 HTF einen monoklonalen Antikörper und Alexa Fluer 6 33 Ziegen Anti-Maus-Immunglobulin G in PBS ohne Kalzium und Magnesium verdünnt. Bereiten Sie anschließend drei Probenröhrchen vor und geben Sie PBS ohne Kalzium und Magnesium ab.

Bei einem pH-Wert von 7,4 werden 7,5 Mikroliter verdünntes alpha CD 1 42 htf ein monoklonaler Antikörper abgegeben und fünf Mikroliter Adenosindiphosphat hinzugefügt. Drehen Sie den Citrat-Vacutainer fünfmal vorsichtig um, um das Blut und das Antikoagulans gründlich zu mischen. Geben Sie fünf Mikroliter Vollblut in jedes Röhrchen.

Die Proben vorsichtig mischen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zur Probenfixierung 300 Mikroliter 1 %PFA in jedes Röhrchen geben und fünf Minuten lang bei 1.500 g zentrifugieren, mit Pause bei Raumtemperatur. Sobald der Überstand entfernt ist, wird das Pellet in 90 Mikrolitern PBS ohne Kalzium und Magnesium durch eine Wiederbelebung suspendiert.

Bei einem pH-Wert von 7,4 geben Sie durch vorsichtiges Pipettieren fünf Mikroliter verdünntes Alexa Fluer 6 33 Immunglobulin G und fünf Mikroliter alpha CD 41 PE in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 300 Mikroliter PBS ohne Kalzium und Magnesium bei pH 7,4 in jedes Röhrchen und mischen Sie.

Erstellen Sie zunächst ein Punktdiagramm für eine vorwärts gerichtete Streufläche und eine seitliche Streufläche auf einer logarithmischen Skala, die alle Ereignisse anzeigt, erstellen Sie ein CD 61 A und ein seitliches Streuflächen-Punktdiagramm auf einer logarithmischen Skala, in der alle Ereignisse angezeigt werden. Um die Thrombozytenpopulation zu visualisieren, stellen Sie den Schwellenwert auf ca. 2000 für die seitliche Streuhöhe und 1000 für die pro CP B sechs 90 H ein.Passen Sie die Verstärkung von PE Y 5 8 5 und pro CP B sechs 90 entsprechend der täglichen Qualitätskontrolle an und stellen Sie die Flussrate auf niedrig ein. Zeichne nun einen Bereich zwischen 10 Strahlen hoch drei und 10 Strahlen hoch fünf, genannt CD 61 positiv.

Um die Thrombozytenpopulation zu identifizieren, duplizieren Sie die FMO und benennen Sie sie in TFIC um. Erfassen Sie die Samples und zeichnen Sie eine Datendatei mit 10.000 Ereignissen innerhalb des positiven Gates von CD 61 auf. Erstellen Sie ein Punktdiagramm für eine vorwärts gerichtete Streufläche und eine seitliche Streufläche auf einer logarithmischen Skala, in der alle Ereignisse angezeigt werden.

Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit CD 41 A und seitlicher Streufläche auf einer logarithmischen Skala, in dem alle Ereignisse angezeigt werden. Passen Sie dann den Alexa Floor 6 33 Gain und den PE Wifi 5 8 5 Gain entsprechend der täglichen Qualitätskontrolle an. Stellen Sie den Schwellenwert auf etwa 1000 für die seitliche Streuhöhe und auf 2.500 für PEY 5 85 ein. H.To Visualisierung der Thrombozytenpopulation, stellen Sie die Flussrate auf niedrig ein.

Zeichnen Sie nun eine Region zwischen 10 Strahlen hoch vier und 10 hoch fünf angehoben, die als CD 41 positiv bezeichnet wird, um die Thrombozytenpopulation zu identifizieren. Erstellen Sie dann für jede Probe ein Röhrchen und nennen Sie TF Unstimulated und TF Stimulated. Entnehmen Sie die Proben und zeichnen Sie eine Datendatei mit 10.000 Ereignissen in der CD 41 Positivgangzentrifuge auf.

Der 0,129 molare Natriumcitrat Vacutainer bei 100 G für 10 Minuten ohne Pause bei Raumtemperatur. Nehmen Sie dann den Vacutainer aus der Zentrifuge. Sammeln Sie das erhaltene plättchenreiche Plasma, übertragen Sie es in ein 10-Milliliter-Polypropylenröhrchen und erfassen Sie das gesammelte Volumen, zählen Sie die Blutplättchen zweimal im plättchenreichen Plasma mit einem Blutkörperchenzähler.

Die durch Alpha-CD 61-Antikörperfärbung identifizierte Thrombozytenpopulation zeigte, dass etwa 26,8 % der zirkulierenden Blutplättchen intrazelluläre Gewebefaktor-Durchflusszytometrie-Analysen enthielten, dass der Gewebefaktor von etwa 2,8 % der ruhenden Blutplättchen exprimiert wird und nach Aktivierung mit Adenosindiphosphat auf 24,5 % ansteigt. Es wurde gezeigt, dass größere Blutplättchen höhere Gewebefaktorspiegel exprimieren, wobei die grünen Punkte die größere Thrombozytenuntergruppe darstellen. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass plättchenreiches Plasma, das mit 100-g-Zentrifugation hergestellt wurde, eine ähnliche Population wie Vollblut beibehielt und größere Blutplättchen mit höherer Gewebefaktor-Positivität beibehielt.

Eine höhere Zentrifugationskraft führte zu einem Verlust größerer Gewebefaktor-positiver Blutplättchen, was durch die reduzierte Vorwärtsstreuung in der PRP-Population angezeigt wird.