Name: Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente RNAi-Methode bei Seidenraupen durch Fütterung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln. Diese Technik ermöglicht genetische Regulationsstudien mit 79% Gen-Silencing-Effizienz.

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<meta charset="utf8"></head><body>Nanopartikel-vermittelte dsRNA-Fütterung für Gen-Silencing in Seidenraupenlarven

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Sangon</td><td>F601620</td><td>für dsRNA oder Nanopartikel Reaktion</td></tr><tr><td>10 &mu; l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>P13473G</td><td>zum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit</td></tr><tr><td>100 μm; l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Q12115G</td><td>zum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit</td></tr><tr><td>2,5 μ; l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>P20777G</td><td>zum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit</td></tr><tr><td>20 μm; l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>H19229E</td><td>zum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit</td></tr><tr><td>200 μm; l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>H20588E</td><td>zum Aspirieren oder Resuspendieren von Flüssigkeit</td></tr><tr><td>6-Wells Clear TC-treated Multiple Well Platten</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>für die individuelle Aufzucht von Seidenraupen</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Aladdin</td><td>A116165</td><td>zur Herstellung von TAE</td></tr><tr><td>Agarose M</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610013</td><td>für Agarose-Gel-Elektrophose</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Sartorius</td><td>BSA224S</td><td>zum Gewicht der Zutaten</td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>Centrisart A-14C</td><td>zur Zentrifugation zur Bildung von dsRNA oder Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646</td><td>zur Kombination mit dsRNA zur Herstellung von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon</td><td>A500895</td><td>zur Herstellung von TAE</td>,</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Aladdin</td><td>E130059</td><td>zur Herstellung von TAE, oder zur dsRNA-Fällung</td></tr><tr><td>Gefrierschrank</td><td>Siemens</td><td>iQ300</td><td>zur Lagerung von dsRNA oder Nanopartikel</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M712</td><td>für PCR-Reaktion</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>für qRT-PCR-Reaktion</td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>I112011</td><td>für dsRNA-Fällung</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>One</td><td>zur Bestimmung der Konzentration von dsRNA</td></tr><tr><td>ph meter</td><td>Sartorius</td><td>&nbsp; PB-10</td><td>zur Herstellung von Puffern</td></tr><tr><td>SanPrep Column PCR Product Purification Kit</td><td>Sangon</td><td>B518141</td><td>für die PCR-Produktreinigung</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>zur Herstellung von 100 mM Natriumacetat-Puffer</td></tr><tr><td>Natriumsulfat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>zur Herstellung von 100 mM Natriumsulfatpuffer</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>für die dsRNA-Synthese</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>C</td><td>für die dsRNA-Erzeugung oder Nanopartikel zum Erhitzen</td></tr> von <tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A501492</td><td>zur Herstellung von TAE</td></tr><tr><td>Vortex&nbsp;</td><td>IKA</td><td>Vortex 3</td><td>zur Herstellung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln</td></tr></tbody></table>

larvale rna-interferenz in der seidenraupe bombyx mori durch verabreichung von chitosan/dsrna-nanopartikeln

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

Um die RNAi-Effizienz zu bewerten, wurde ein Immungen zur Analyse ausgewählt, das auf BmToll9-2 abzielt. Das BmToll9-2-Gen ist im Labor gut charakterisiert, und das Gen-Silencing durch dsRNA-Injektion führt zu leichteren und kleineren Larven in unserer jüngsten Veröffentlichung20. Um die RNAi-Wirksamkeit durch Aufnahme durch Chitosan/dsRNA-Nanopartikel zu bestätigen, wurden Chitosan-Nanopartikel als Kontrolle verwendet und gleichzeitig nackte dsRNA verglichen.
Im Vergleich zur Kontrolle, Chitosan-Nanopartikeln ohne dsRNA, zeigt nackte dsRNA, die auf das BmToll9-2-Gen abzielt, keinen Silencing-Effekt. Die Fütterung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in die Seidenraupe hemmt das Transkript signifikant, mit einem Knockdown von 79 % (Abbildung 1). Die Hemmung des relativen Transkripts deutet darauf hin, dass das BmToll9-2-Gen durch Chitosan/dsRNA-Einnahme erfolgreich zum Schweigen gebracht wurde.
Der Knockdown des BmToll9-2-Gens beeinflusst das Wachstum der Seidenraupe erheblich. Bei der Beobachtung der Larven sind die BmToll9-2-stummgeschalteten Larven kleiner als die Kontrolllarven (Abbildung 2A). Beim Vergleich der Kokons sind die BmToll9-2-gedämpften Kokons ebenfalls kleiner (Abbildung 2B). Chitosan/dsRNA-Nanopartikel zeigen erfolgreiche RNAi-Effekte sowohl im Transkript als auch im Phänotyp bei der Seidenraupe.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Relatives Transkript von BmToll9-2 nach Aufnahme von Chitosan/dsBmToll9-2-Nanopartikeln in Larven des 5. Stadiums von B. mori. Die relativen mRNA-Spiegel von BmToll9-2 in den Larven, die mit Chitosan-Nanopartikeln als Kontrolle, nackter dsRNA und Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln gefüttert wurden. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikationen dargestellt. Für jede biologische Replikation gab es drei technische Replikationen. Unterschiedliche Buchstaben auf den Balken weisen auf signifikante Unterschiede hin, die auf der unidirektionalen ANOVA-Analyse basieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Phänotypbeobachtung nach Fütterung mit Chitosan/dsBmToll9-2 Nanopartikeln. Chitosan-Nanopartikel werden als Kontrolle verwendet. (A) Das Auftreten von Seidenraupenlarven nach der Einnahme von Nanopartikeln. (B) Das Auftreten von Seidenraupenkokons nach der Einnahme von Nanopartikeln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig02largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...

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Larven RNA-Interferenz in das rote Mehlkäfer, Tribolium castaneum

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