Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Wir sind daran interessiert, die molekularen Grundlagen von neurologischen Entwicklungsstörungen zu definieren, die mit Genvarianten in Enzymen des Ubiquitin-Systems verbunden sind. Wir verwenden modernste Techniken, um die von diesen Enzymen gesteuerten Signalwege zu entschlüsseln und den Einfluss von Genvarianten auf die Proteinbiologie zu bestimmen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass es sich um eine substratunabhängige Technik handelt, die keine Vorkenntnisse über die Substrate erfordert, die durch einen spezifischen DUB geregelt werden.

Auf diese Weise können wir den Einfluss der mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziierten Genvarianz auf die katalytische Aktivität von DUB direkt messen und mögliche pathogene Mechanismen vorschlagen. Da die zellulären Funktionen der meisten DUBs nur unzureichend verstanden sind, wird sich unser Labor darauf konzentrieren, die Signalwege zu identifizieren, die diese Enzyme vermitteln, und wie Genvarianten, die mit genetischen Erkrankungen assoziiert sind, diese Prozesse beeinflussen. Tauen Sie zunächst unmittelbar vor der Verwendung 20 Mikroliter chemisch kompetente Rosetta 2 Escherichia coli-Zellen auf Eis auf.

Geben Sie ein bis 10 Nanogramm des pGEX6P1 USP27X-Expressionsplasmids hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf Eis. Hitzeschocken Sie die Zellen 30 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius in einem trockenen Bad. Dann inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang auf Eis.

Geben Sie 80 Mikroliter SOC-Medium bei Raumtemperatur in die Zellen. Inkubieren Sie 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und einer Drehung von 200 U/min in einem temperaturgesteuerten Tischschüttler mit einer Umlaufbahn von 19 Millimetern. Dann gibst du 50 Mikroliter der Kultur auf eine LB-Agarplatte, ergänzt mit Chloramphenicol und Ampicillin.

Inkubieren Sie 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit dem Deckel nach unten in einem temperaturgesteuerten Inkubator. Wählen Sie eine einzelne Kolonie transformierter Bakterien und fügen Sie sie zu 10 Millilitern sterilem LB-Medium hinzu, das mit Chloramphenicol und Ampicillin ergänzt ist. Inkubieren Sie 20 Stunden lang, wie zuvor gezeigt.

Geben Sie dann 10 Milliliter der Übernachtkultur in einen Liter TB-Medium, das mit Chloramphenicol und Ampicillin ergänzt ist. Inkubieren, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,5 bis 0,6 erreicht. Als nächstes fügen Sie der Kultur 50-mikromolares Isopropyl-beta-d-1-thiogalactopyranosid hinzu, um die Expression zu induzieren.

Nach dem Abkühlen der Probe auf 16 Grad Celsius wird sie 20 Stunden lang bei 16 Grad Celsius mit einer Umdrehung von 200 U/min inkubiert. Zentrifugieren Sie die Zellen dann 20 Minuten lang bei 3000 g oder höher bei vier Grad Celsius, um die Zellen aus der Expressionskultur zu pelletieren. Zum Schluss lagern Sie das Pellet mindestens eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius.

Sichern Sie zunächst die leere Schwerkraftsäule in einem Retortenständer. Füllen Sie die Säule mit zwei bis drei Millilitern Gluthathion-Agarose-Harz, um ein Zellpellet zu reinigen, das aus einem Liter Expressionskultur gewonnen wurde. Waschen Sie die Säule mit einem Harzbettvolumen von 20 % Ethanol.

Tauen Sie das Zellpellet nach dem Waschen der Säule bei vier Grad Celsius auf. Geben Sie 30 Milliliter MS500-Puffer zu dem aufgetauten Pellet und inkubieren Sie es mit sanfter End-over-End-Rotation. Nun beschallen Sie die lysierten Zellen in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis, bis das Lysat frei fließt, wenn es aus einer Pipettenspitze abgegeben wird.

30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 20.000 G oder höher zentrifugieren, um den Überstand zu reinigen. Anschließend wird der Überstand in ein Becherglas umgefüllt und das gereinigte Lysat auf die Säule geladen. Lassen Sie das Lysat durch die Schwerkraft durch die Säule laufen, während Sie den Durchfluss auffangen.

Waschen Sie anschließend die Säule mit mindestens zwei Harzbettvolumina MS500 Waschpuffer und sammeln Sie den Waschdurchfluss in fünf Milliliterfraktionen. Fügen Sie als Nächstes einen Mikroliter jeder Fraktion zu 100 Mikrolitern Bradford-Reagenz hinzu, um das Vorhandensein von Proteinen zu überprüfen. Das Protein wird zurückgewonnen, indem der MS500-Elusionspuffer durch die Säule geleitet und fünf Milliliter-Elutionsfraktionen gesammelt werden.

Um das Protein auszufällen, fügen Sie dem Eluat zwei Volumen viermolaren Ammoniumsulfats hinzu und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, bis es trüb wird. 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 20.000 g oder mehr zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand nach jeder Zentrifugation, ohne das Proteinpellet zu stören.

Lösen Sie dann das Protein erneut in MS500-Puffer auf, der mit 25 % Glycerin ergänzt ist, bevor Sie es lagern. Bereiten Sie 10 Mikroliter gereinigtes, GST-markiertes USP27X in einem deubiquitylierenden Enzymaktivierungspuffer für jeden Zeitpunkt für jedes deubiquitylierende Enzym vor. Geben Sie vor der Zugabe von Ubiquitinketten sieben Mikroliter SDS-PAGE-Ladepuffer zur Zeit-Null-Probe, um zu verhindern, dass die Deubiquitylierungsreaktion beginnt.

Zu jedem Zeitpunkt für jedes deubiquitylierende Enzym werden 375 Nanogramm K63-verknüpfte Diubiquitinketten hinzugefügt, die in 10 Mikrolitern Enzymaktivierungspuffer verdünnt sind. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius und stoppen Sie jeden Zeitpunkt durch Zugabe von sieben Mikrolitern SDS-PAGE-Ladepuffer. Führen Sie SDS-PAGE mit einem Gel mit vier bis 12 % Gradient durch.

Wildtyp USP27X spaltete K63-verknüpfte Di-Ubiquitin-Ketten nach einstündiger Inkubation in Mono-Ubiquitin. Die XLID-105-assoziierte Varianz F313V, Y381H und S404N spaltete K63-verknüpfte Di-Ubiquitin-Ketten nach einstündiger Inkubation nicht.