Name: Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die enzymatische Aktivität von Deubiquitinylasen messen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind. Dieses substratunabhängige Verfahren nutzt rekombinante Proteinreinigung und Ubiquitin-Kettenspaltungsassays.

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Das folgende Protokoll kann für rekombinante Proteine angepasst werden, indem verschiedene Affinitätsmarkierungen verwendet werden, die in verschiedenen Stämmen kompetenter Zellen exprimiert werden. Abhängig vom zu exprimierenden Protein können die Kultivierungs- und Übernacht-Expressionsbedingungen eine Optimierung des OD600 bei der Expressionsinduktion, der Expressionszeit, der Expressionstemperatur und der IPTG-Konzentration erfordern. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Transformation kompetenter Rosetta 2 E. coli Zellen mit dem rekombinanten GST-USP27X-Expressionsplasmid
HINWEIS: Um die Sterilität der Bakterienkultur zu erhalten, führen Sie Schritte durch, bei denen die Medienbehälter unter einer Bunsenbrennerflamme geöffnet sind. Um einen optimalen Sauerstofftransfer zu ermöglichen, führen Sie das Schütteln der Bakterienkultur in einem temperaturgesteuerten Tischschüttler mit einer Umlaufbahn von 19 mm bis 50 mm und einer Drehzahl von 200 U/mindurch 29.
<ol>
	<li>20 μl chemisch kompetente Rosetta 2 E. coli-Zellen unmittelbar vor der Verwendung auf Eis auftauen. 1-10 ng des pGEX6P1-USP27X-Expressionsplasmids (kodiert für N-terminale Glutathion-S-Transferase (GST)30 -markiertes USP27X und mit Ampicillin-Resistenz) und 5 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Hitzeschock für 30 s bei 42 °C in einem trockenen Bad. 2 Min. auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 80 μl SOC-Medium bei Raumtemperatur (RT) hinzu. Inkubieren Sie 60 Minuten lang bei 37 °C und einer Drehung von 200 U/min in einem temperaturgesteuerten Tischschüttler mit 19 mm Orbit.</li>
	<li>Platte: 50 μl Kultur auf einer LB-Agarplatte, ergänzt mit 25 μg/l Chloramphenicol und 50 μg/l Ampicillin. 20 h bei 37 °C mit dem Deckel nach unten in einem temperierten Inkubator inkubieren.</li>
</ol>
2. Bakterielle Expression des rekombinanten Proteins aus dem Expressionsplasmid über Nacht
HINWEISE: Um die Sterilität der Bakterienkultur zu erhalten, führen Sie Schritte durch, bei denen die Medienbehälter unter einer Bunsenbrennerflamme geöffnet sind. Um einen optimalen Sauerstofftransfer zu ermöglichen, führen Sie das Schütteln der Bakterienkultur in einem temperaturgesteuerten Tischschüttler mit einer Umlaufbahn von 19 mm bis 50 mm und einer Drehzahl von 200 U/mindurch 29. Messen Sie die Kultur OD600 mit einem Spektralphotometer.
<ol>
	<li>Bereiten Sie 1 l Terrific Broth (TB)-Medium vor, indem Sie 47,6 g TB-Pulver zu 1 l Reinstwasser mit 0,4 % Glycerin in einem 2-l-Kulturkolben mit Blende geben. Medium 30 min lang autoklavieren und auf RT abkühlen lassen.</li>
	<li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie transformierter Bakterien und fügen Sie 10 ml steriles LB-Medium hinzu, das mit 25 μg/l Chloramphenicol und 50 μg/l Ampicillin ergänzt wird. Inkubieren Sie 20 Stunden lang bei 37 °C und einer Drehung von 200 U/min in einem temperaturgesteuerten Tischschüttler mit 19 mm Orbit.</li>
	<li>Geben Sie 10 ml Übernachtkultur zu 1 l TB-Medium, ergänzt mit 25 μg/l Chloramphenicol und 50 μg/l Ampicillin (Verhältnis von 1:100 zwischen Ausgangskultur und Expressionskultur). Inkubieren Sie bei 37 °C mit einer Drehung von 200 U/min in einem temperaturgesteuerten Tischschüttler mit einer Umlaufbahn von 19 mm, bis der Kultur-OD600 zwischen 0,5 und 0,6 liegt.</li>
	<li>Geben Sie 50 μM IPTG in die Kultur, um die Expression zu induzieren, kühlen Sie auf 16 °C ab und inkubieren Sie 20 Stunden lang bei 16 °C mit einer Drehung von 200 U/min.</li>
	<li>Pelletzellen aus Expressionskultur durch Zentrifugation für 20 min bei ≥3.000 x g und 4 °C. Lagern Sie das Pellet bei -80 °C für mindestens 1 h. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann das Experiment pausiert und später (vorzugsweise in derselben Woche) erneut gestartet werden. Das Pellet kann langfristig bei -80 °C gelagert werden.</li>
</ol>
3. Proteinaufreinigung durch Schwerkraft-Flow-Affinitätssäule
HINWEIS: Die für jede Aufreinigung geeigneten Harz-, Bindungs-, Wasch-, Elutions- und Lagerpuffer hängen von dem zu reinigenden rekombinanten Protein ab. Sammeln Sie Proben aus dem Zellpellet, dem Überstand, den Durchflussfraktionen, den Waschfraktionen und den Elutionsfraktionen im SDS-PAGE-Puffer. Führen Sie SDS-PAGE- und Coomassie-Färbungen für die Proben durch, um den Erfolg der Aufreinigung zu bewerten. Führen Sie die Reinigung bei 4 °C durch und behandeln Sie Fraktionen auf Eis. Die Spaltung von Protein-Tags kann an oder außerhalb der Säule unter Verwendung der geeigneten Protease durchgeführt werden, um die relevante Protease-spezifische Spaltstelle zu erreichen.
<ol>
	<li>Befestigen Sie die leere Schwerkraft-Flow-Säule im Retortenständer und füllen Sie sie mit Glutathion-Agarose-Harz. Verwenden Sie 2-3 ml Harz, um ein Zellpellet zu reinigen, das aus 1 l Expressionskultur gewonnen wurde.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit einem Harzbettvolumen von 20 % Ethanol. Waschen Sie die Säule 3 Mal mit einem Harzbettvolumen MS500 Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP). Stoppen Sie die Säule, damit das Harz mit Puffer bedeckt bleibt, um ein Austrocknen während der Vorbereitung des Zellpellets zu verhindern.</li>
	<li>Tauen Sie das Küvettenpellet bei 4 °C auf. Geben Sie 30 ml MS500-Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 60 mg Lysozym und eine Proteasehemmer-Tablette) zum aufgetauten Pellet. 30 min bei 4 °C mit sanfter End-over-End-Drehung lysieren.</li>
	<li>Beschallen Sie die lysierten Zellen entweder in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen oder einem Metallbecherglas auf Eis, bis das Lysat frei fließt, wenn es aus einer Pipettenspitze abgegeben wird. 30 min bei 4 °C und ≥20.000 x g zentrifugieren, um den Überstand zu reinigen. HINWEIS: Bestimmen Sie die Einstellungen des Ultraschallgeräts empirisch. Stellen Sie den Ultraschallator so ein, dass eine Gesamtzeit von 120 s ausreicht, um das viskose Lysat zu einer rieselfähigen und transparenten Flüssigkeit zu reduzieren.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Überstand in ein Becherglas und laden Sie das gereinigte Lysat auf die Säule. Lassen Sie das Lysat durch die Schwerkraft durch die Säule laufen, während Sie den Durchfluss auffangen. Laden Sie die Spalte mit dem gesammelten Flow-Through und führen Sie ihn durch die Spalte.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule 5 Mal mit mindestens zwei Harzbettvolumina MS500 Waschpuffer (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP). Sammeln Sie den Waschfluss in 5-ml-Fraktionen. Fügen Sie 1 μl jeder Fraktion zu 100 μl Bradford-Reagenz hinzu, um das Vorhandensein von Proteinen visuell zu überprüfen. Waschen Sie, bis bei der letzten Wäsche kein ungebundenes Protein mehr vorhanden ist, und fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Waschschritte hinzu.</li>
	<li>Das Protein wird zurückgewonnen, indem MS500-Elutionspuffer (MS500-Puffer, ergänzt mit 10 mM Glutathion und 10 mM NaOH) durch die Säule geführt und 5 ml-Elutionsfraktionen gesammelt werden. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Proteinen, indem Sie 1 μl Eluat zu 100 μl Bradford-Reagenz hinzufügen. Hören Sie auf, Fraktionen zu sammeln, wenn das Bradford-Reagenz nicht mehr anzeigt, dass Proteine vorhanden sind.</li>
	<li>Führen Sie den Pufferaustausch durch Fällung und Zentrifugation durch. Fältitieren Sie das Protein, indem Sie dem Eluat 2 Volumen von 4 M Ammoniumsulfat zufügen, es sanft invertieren, bis es trüb ist, und dann 30 Minuten lang bei 4 °C und ≥20.000 x g zentrifugieren und erneut weitere 5 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand nach jeder Zentrifugation, ohne das Proteinpellet zu stören.</li>
	<li>Lösen Sie das Protein in MS500, ergänzt mit 25% Glycerin, wieder auf und speichern Sie es. Lagern Sie Proteinpellets oder Protein in Lagerpuffer bei -80 °C.</li>
</ol>
4. In-vitro-Assay für die Ubiquitin-Kettenspaltung
HINWEIS: Wählen Sie die Länge der Ubiquitinkette und die Verknüpfungstypen basierend auf der DUB-Spezifität aus, die in früheren Berichten31 beschrieben oder empirisch bestimmt wurde. Falls erforderlich, könnte dieses Protokoll verwendet werden, um die Aktivität des interessierenden Wildtyp-DUB an einem Panel kommerziell erhältlicher Ubiquitinketten definierter Länge und Kopplungsart zu testen. Eine Di-Ubiquitin-Kettenmenge von 375-750 ng und eine DUB-Konzentration von 1-2 μM können als Ausgangspunkte für den Assayverwendet werden 27.
<ol>
	<li>Bereiten Sie 10x DUB-Aktivierungspuffer vor (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl und 100 mM TCEP).</li>
	<li>Bereiten Sie für jeden Zeitpunkt für jeden DUB insgesamt 10 μl 2 μM gereinigtes GST-USP27X in 1x DUB-Aktivierungspuffer (DUB-Mix) vor. Bereiten Sie Master-Mixe vor und teilen Sie sie in Zeitpunkte auf.</li>
	<li>Inkubieren Sie den DUB-Mix 10 Minuten lang bei RT.</li>
	<li>Fügen Sie 7 μl SDS-PAGE-Ladepuffer zum Zeitpunkt 0 hinzu, bevor Sie Ubiquitinketten hinzufügen, um den Start der Deubiquitylierungsreaktion zu verhindern.</li>
	<li>Zu jedem Zeitpunkt für jeden DUB werden 375 ng K-63-Diubiquitinketten hinzugefügt, die in 10 μl 1x DUB-Aktivierungspuffer verdünnt sind. Das Gesamtvolumen beträgt 20 μL pro Reaktion.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 °C und stoppen Sie jeden Zeitpunkt mit 7 μl SDS-PAGE-Ladepuffer.</li>
	<li>Führen Sie die SDS-PAGE mit einem 4%-12%-Gradientengel und Immunoblot 7,32 für Ubiquitin und USP27X durch, um die Veränderung des Mono-Ubiquitin-Vorhandenseins über ausgewählte Zeitpunkte zu analysieren.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Studiendesigns. (A) Transformation von kompetenten E. coli-Zellen mit rekombinantem Proteinexpressionsplasmid. (B) Bakterielle Expression des rekombinanten Deubiquitylase-Proteins über Nacht. (C) Proteinaufreinigung der rekombinanten Deubiquitylase unter Verwendung einer Schwerkraft-Strömungs-Affinitätssäule. (D) In-vitro-Experiment zur Teilung der Ubiquitinkette zur Bewertung der Deubiquitylierungsaktivität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Beurteilung von DUB-Varianten bei neurologischen Entwicklungsstörungen mit Hilfe eines Spaltungsassays

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<li>Ritorto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+DUB+activity+and+specificity+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nat Commun. 5, 4763(2014).</li>
<li>Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0,45 NC 200 mm &times 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin (Maus monoklonal)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269</td><td>(WB: 1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-GST (Schaf polyklonal)</td><td>MRC-PPU Reagenzien und Dienstleistungen</td><td>Kat # S902A Dritte Blutung</td> <td>(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Gefüllte Kulturflaschen 2 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagenz</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Komplett, Proteasehemmer Tabletten</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>Econo-Säule 1,5 & 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1,5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/ </td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr> <tr><td>Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 Well Gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranosid)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey Anti-Goat IgG Sekundärer Antikörper</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td> <td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Esel Anti-Maus IgG Sekundärer Antikörper</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212</td> <td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>Isotemp Digitales Trockenbad</td><td>Fisher</td><td>Scientific 88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 Di-Ubiquitin</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker</td><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS Laufpuffer</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS Probenpuffer 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odyssee&nbsp; Fc Imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X</td><td>MRC-PPU Reagenzien und Dienstleistungen</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 human USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutathion Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbat 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 Competent Cells</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris-(carboxyethyl)phosphinhydrochlorid)</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth Powder</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell und XCell II Blot Modul&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der enzymatischen aktivität von enzymen, die mit neurologischen entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro ubiquitin-kettenspaltungsassays

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Um den Einfluss von XLID105-assoziierten Varianten auf die katalytische Aktivität von USP27X zu bestimmen, wurden GST-markierte Wildtyp-Proteine USP27X und die XLID105-assoziierten Varianten F313V, Y381H und S404N USP27X-Proteine aus Bakterien aufgereinigt. Diese Varianten befinden sich innerhalb der USP-katalytischen Domäne von USP27X (Abbildung 2A). Da zuvor berichtet wurde, dass USP27X die K63-Ubiquitinketten31 spaltet, wurden Wildtyp-USP27X und die XLID105-assoziierten Varianten F313V, Y381H und S404N USP27X-Proteine 1 h lang mit K63-verknüpften Di-Ubiquitin-Ketten inkubiert. Diese Proben wurden mittels SDS-PAGE32 getrennt, und Ubiquitin und USP27X-Proteine wurden mittels Immunblotting analysiert. Der Wildtyp USP27X induziert die Di-Ubiquitin-Spaltung und erzeugt Mono-Ubiquitin (Abbildung 2B und ergänzende Abbildung 1). XLID105-assoziierte Proteine der F313V-, Y381H- und S404N-USP27X-Varianten spalteten diese Ketten nicht. Da die Varianten F313V, Y381H und S404N die katalytische Aktivität von USP27X stören, scheint die funktionelle Störung von USP27X der Hauptmechanismus zu sein, der XLID1057 zugrunde liegt. Zusätzliche Quantifizierungen und ergänzende Experimente wurden bereits berichtet7.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg"> 
Abbildung 2: Einfluss XLID105 Varianten auf die Deubiquitylierungsaktivität von USP27X. (A) Diagramm der humanen USP27X-Proteinstruktur mit den Restzahlen und der Position der XLID105 Varianten, die in der USP-Domäne ausgewertet wurden (violett). (B) GST-markierte Wildtyp-Varianten USP27X und XLID105 (F313V, Y381H und S404N) wurden für die angegebenen Zeiten mit K63-Di-Ubiquitin-Ketten inkubiert. Die Immunoblot-Analyse wurde mit Anti-GST (USP27X) und Ubiquitin-Antikörpern durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Ungeschnittene Kleckse von Abbildung 2B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

measuring-enzymatic-activity-neurodevelopmental-disorder-associated

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen...

Detektion von Protein Ubiquitination

Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase.  Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

Eine einfache und skalierbare Methode wurde entwickelt, um die funktionelle Bedeutung von Missense-Varianten in Ube3a zu bewerten, einem Gen, dessen Verlust und Funktionsgewinn sowohl mit dem Angelman-Syndrom als auch mit der Autismus-Spektrum-Störung verbunden sind.

Eine skalierbare, zellbasierte Methode zur funktionellen Bewertung von Ube3a-Varianten

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit Sondentechnologien, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen der traditionellen chinesischen Medizin und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Screening von Wirkstoffen der traditionellen chinesischen Medizin zur Hemmung der UCHL3-Aktivität basierend auf molekularer Docking- und Deubiquitinierungsenzymsondentechnologie

Ein Hochdurchsatz-Assay für das Enzym-Screening wird beschrieben. Dieses gebrauchsfertige Multiplex-Assay-Kit besteht aus vorausgewählten C-hromogenen P-Olymer-H-Ydrogel-Substraten (CPH) und komplexenI-nlöslichen C-hromogenen B-iomasse(ICB)-Substraten. Zielenzyme sind Polysaccharid-abbauende Endoenzyme und Proteasen.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) wird in der G2-Phase des Zellzyklus aktiviert und reguliert viele zelluläre Signalwege. Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine in-vitro- Kinase Assay mit Cdk1, wodurch die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites für zellulare Ziele von diesem wichtigen Kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Erfahren Sie, wie Sie die enzymatische Aktivität von Deubiquitinylasen messen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind. Dieses substratunabhängige Verfahren nutzt rekombinante Proteinreinigung und Ubiquitin-Kettenspaltungsassays.

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays (Video) | JoVE Journal

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

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