Ein Mausmodell der hämorrhagischen Transformation, die durch akute Hyperglykämie in Kombination mit transienter fokaler Ischämie induziert wird

In der aktuellen Forschung wollen wir ein umfassendes und detailliertes Protokoll für die Etablierung eines hochgradig reproduzierbaren Tiermodells der humanen Radikaltransformation unter Verwendung der Reperfusion des Verschlusses der mittleren Hirnarterie bei C57BL/6-Mäusen mit akuter Hyperglykämie bereitstellen.

Im Vergleich zu anderen Techniken weist unser Protokoll eine gute Wiederholbarkeit, eine hohe Stabilität und eine niedrige Tiersterblichkeit auf, wodurch es für einen breiten Einsatz in der präklinischen Forschung zur hämorrhagischen Transformation geeignet ist.

In Zukunft werden wir uns darauf konzentrieren, den Einfluss der hämorrhagischen Transformation auf die Neurologie zu untersuchen und den zugrunde liegenden Mechanismus zu erforschen.

[Dozent] Wischen Sie zunächst die Operationsplattform und den umliegenden Arbeitsbereich mit 75 % Ethanol ab. Schalten Sie den Heizungsschalter ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Bewegen Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf die Operationsplattform und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband. Verabreichen Sie den Mäusen dann 15 Minuten vor dem chirurgischen Eingriff intraperitoneal 30% Glukose oder normale Kochsalzlösung. Machen Sie mit einem Skalpell einen horizontalen Schnitt mit einer Öffnung von 1,5 Zentimetern entlang der Mittellinie des Halses. Führen Sie eine stumpfe Dissektion im Bereich des umgekehrten Dreiecks durch, um die linke Arteria carotis communis zu identifizieren und zu trennen. Präparieren Sie mit einer Augenzange den Vagusnerv, der an die Arteria carotis communis angrenzt, und das Schleimhautgewebe, das die Blutgefäße umgibt. Machen Sie mit einer 5-0 Polyglykolsäure resorbierbaren Naht einen Ringer an der Arteria carotis communis und halten Sie die Naht frei. Trennen Sie dann entlang der Arteria carotis communis nach oben. Trennen Sie nun die Bifurkation, um die äußere und die innere Halsschlagader vollständig freizulegen. Schlingen Sie eine 5-0 Polyglykolsäure resorbierbare Naht um die äußere Halsschlagader distal von der Bifurkation und binden Sie sie fest. Als nächstes klemmen Sie mit zwei leichten Mikro-Serrafin-Arterienklemmen vorübergehend sowohl die Arteria carotis communis als auch die Arteria carotis interna ab, um den Blutfluss zu blockieren. Dehnen Sie dann den Nahtbinder an der distalen Halsschlagader externa und der Arteria carotis communis, um das Segment der Arteria carotis externa zu begradigen. Machen Sie nun mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt zwischen den beiden Nahtbindern an der Arteria carotis externa. Führen Sie eine 30 Millimeter lange, silikonbeschichtete monofile Naht in die äußere Halsschlagader ein. Schlingen Sie eine zweite 5-0 Polyglykolsäure resorbierbare Naht um die äußere Halsschlagader in der Nähe der Bifurkation und binden Sie sie leicht zusammen, um zu verhindern, dass sich die monofile Naht zurückzieht. Schneiden Sie dann die Arteria carotis externa distal der permanenten Ligatur vollständig ab und entfernen Sie die Zangenklemme aus der Arteria carotis interna. Ziehen Sie dann die Naht bis zur Bifurkation der Arteria carotis communis zurück. Ziehen Sie den Stumpf der äußeren Halsschlagader vorsichtig zurück und drehen Sie ihn. Passen Sie die Nahtrichtung an und führen Sie sie 9 bis 10 Millimeter von der Bifurkation der Arteria carotis communis in die Arteria carotis interna ein, um die mittlere Hirnarterie zu blockieren. Ziehen Sie dann die zweite Polyglykolsäure-resorbierbare Naht um die Arteria carotis externa fest und entfernen Sie die Arterienklemme von der Arteria carotis communis. Nachdem Sie die Maus mit einer Mikroclip-Arterienklemme erneut betäubt haben, klemmen Sie die Arteria carotis communis ein. Ziehen Sie das Monofilament teilweise aus der Arteria carotis interna zurück, bis die silikonbeschichtete Spitze durch die Arteria carotis interna sichtbar wird. Platzieren Sie dann eine weitere Microclip-Arterienklemme auf der Arteria carotis interna oberhalb der silikonbeschichteten Spitze. Ziehen Sie das Monofilament vollständig zurück und legen Sie den Stumpf der Arteria carotis externa fest an. Entfernen Sie abschließend die Microclip-Arterienklemme von der Arteria carotis interna bzw. der Arteria carotis communis. Wischen Sie zunächst den Schwanz der Maus mit einem alkoholgetränkten Wattebausch ab, um die Schwanzvene vollständig hyperämisch zu machen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Schwanzspitze um ein bis zwei Millimeter ab. Drücke vorsichtig entlang der Schwanzwurzel bis zur Spitze, um den Blutfluss aus dem Schnitt zu erleichtern. Positionieren Sie dann den Probenabsorptionsbehälter des Testpapiers am Rand des Blutstropfens. Lesen Sie den Messwert des Blutzuckermessgeräts ab und notieren Sie das Ergebnis. Halten Sie für die Messung des zerebralen Blutflusses die Spitze der Laser-Doppler-Flowmetrie-Sonde senkrecht zur Oberfläche des linken Parietalschädels, bis ein stabiler Fluss gemessen wird, und notieren Sie diesen Wert. Nachdem Sie das Gehirn der euthanasierten MCAO-Maus entfernt haben, legen Sie das Hirngewebe in eine Nagetier-Hirnmatrix und schneiden Sie es in zwei Millimeter große koronale Scheiben. Die Scheiben auf eine 24-Well-Platte geben und mit 2%iger 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Lösung bei 37 Grad Celsius 15 Minuten lang inkubieren. Schneiden Sie anschließend die Gewebeschnitte mit einer gebogenen Pinzette aus der 24-Well-Platte heraus und ordnen Sie sie auf der Glasscanplatte an. Färben Sie das fixierte Hirnschnitt drei Minuten lang mit Hämatoxylinlösung. Unterscheiden Sie es, indem Sie die Scheibe fünf Sekunden lang in 5%igen Salzsäurealkohol tauchen. Dann dehydrieren und hyalinisieren Sie die Scheibe mit Gradienten-Ethanollösungen und Xylol. Montieren Sie den Abschnitt mit neutralen Harzen. 23 Stunden nach der MCAO injizieren Sie 2% Evans Blue Lösung in die Maus und ernten Sie das Gehirn. Nach dem Homogenisieren und Zentrifugieren des Gewebes wird die überstehende Flüssigkeit in ein weiteres Zentrifugenröhrchen überführt und mit Ethanol vierfach verdünnt. Messen Sie die Extinktion der überstehenden Flüssigkeit bei 620 Nanometern mit einem Spektralphotometer. Injizieren Sie FITC-Dextran 24 Stunden nach der MCAO in die Schwanzvene und lassen Sie es 10 Minuten lang im Blut zirkulieren. Nachdem Sie das Hirngewebe fixiert haben, betten Sie das Hirngewebe mit einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur ein und schneiden Sie es in 30 Mikrometer dicke Abschnitte. Übertragen Sie die Schnitte mit einer Impfschlaufe auf einen Objektträger und stellen Sie sicher, dass sie auf der Oberfläche des Objektträgers haften. Montieren Sie die Hirngewebeschnitte mit einem Einbettmedium, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol enthält. Der Blutzuckerspiegel stieg nach MCAO bei Mäusen, denen Glukose injiziert wurde, im Vergleich zu den Kochsalzgruppen signifikant an. Kein sichtbarer Infarkt wurde an Hirnschnitten in der Scheingruppe mit Kochsalzlösung oder Scheinglukose beobachtet. Die MCAO mit Glukosegruppe zeigte ein signifikant größeres Hirninfarktvolumen im Vergleich zur MCAO mit Kochsalzlösung. In der ischämischen Hemisphäre der MCAO wurden bei der Glukosegruppe multiple punktuelle Blutungen beobachtet, die in den anderen Gruppen fehlten. Eine signifikante Infiltration von Blutzellen wurde in den Infarktregionen des Kortex und des Striatums in der MCAO-Gruppe mit Glukose festgestellt. Die Evans-Blue-Permeabilität und die FITC-Dextran-Leckage waren in der MCAO-Gruppe mit Glukose deutlich höher als in der MCAO-Gruppe mit Kochsalzlösung.