Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Wir wollen das Zusammenspiel von Krebs- und Immunzellen untersuchen, um besser zu verstehen, wie sie während der Metastasierung interagieren. In den meisten Fällen sind in vivo Modelle der routinemäßige Weg, um Forschungsfragen zur 3D-Invasion von Krebszellen im Kontext des Immunsystems nachzugehen, oder isolierte Komponenten des Systems stehen im Fokus. Eine Methode, die die Analyse des zellulären Verhaltens ermöglicht, die die Komplexität der In-vivo-Situation nachahmt, aber eine direktere Manipulation spezifischer Umwelteigenschaften unter dem Mikroskop ermöglicht.

Wir zeigen, dass unveränderte Krebszellen die Invasion in die 3D-Kollagen-I-Matrix reduzieren, wenn sie zusammen mit Makrophagen kultiviert werden, die für das Motorprotein KIF16B abgereichert wurden. Dies deutet auf eine Rolle des KIF16B-getriebenen Recyclings von Makrophagen-Oberflächenproteinen in der Tumormikroumgebung hin. Wir möchten unsere Methode so weiterentwickeln, dass der Matrixabbau an der Schnittstelle zwischen Makrophagen-Krebszellen sichtbar gemacht werden kann, um so ein besseres Verständnis der abbauenden und adhäsiven Mechanismen zu erhalten.

Kultivieren Sie zunächst H1299-GFP-Zellen mit einem Krebszellmedium in einem 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis sie 80 % Konfluenz erreichen. Waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS und fügen Sie einen Milliliter Trypsin-EDTA für zwei bis drei Minuten hinzu, bis sich die Zellen gelöst haben. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von zwei Millilitern Krebszellmedien.

Als nächstes zentrifugieren Sie die abgelöste Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei 245 g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, der die Trypsinlösung enthält, bevor Sie das Pellet mit fünf Millilitern DPBS waschen. Nach der Zentrifugation wird das Pellet in fünf Millilitern Krebszellmedium wieder suspendiert.

Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer. Übertragen Sie 8.000 Zellen in eine 96-Well-Platte mit extrem geringer Adhäsion in einem Endvolumen von 25 Mikrolitern Krebszellmedium. Inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Überprüfen Sie nach drei Tagen die Sphäroide unter dem Mikroskop auf Gleichmäßigkeit. Nach der Entnahme der menschlichen Blutprobe werden 20 Milliliter Blut aus einem Transfusionsbeutel in ein 50-Milliliter-Reaktionsröhrchen überführt. Geben Sie 15 Milliliter Lymphozytentrennmedium in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.

Übertragen Sie vorsichtig 20 Milliliter Blut ohne Mischen in das Lymphozytentrennmedium-haltige Röhrchen und zentrifugieren Sie das Gemisch bei 450 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Während der Zentrifugation 10 Milliliter kaltes RPMI 1640 Medium in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen geben. Nach der Zentrifugation wird die dichte weiße Phase aus dem bluthaltigen Röhrchen in das vorbereitete RPMI-haltige Röhrchen überführt und bis zu 50 Milliliter mit kaltem RPMI gefüllt.

Die Suspension wird bei 450 g 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand verworfen. Suspendieren Sie das Pellet wieder in 10 Millilitern kaltem RPMI und füllen Sie es bis zu 50 Milliliter mit RPMI 1640. Zentrifugieren Sie die Mischung erneut und suspendieren Sie das Pellet wieder in 50 Millilitern U/min.

Zentrifugieren Sie die Probe erneut und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 1,5 Millilitern kaltem Monozytenpuffer. Geben Sie anschließend 250 Mikroliter Anti-CD14-Mikroperlen in die Zellsuspension und inkubieren Sie 15 Minuten lang auf Eis. Bereiten Sie während der Inkubation eine Trennsäule vor, indem Sie einen Filter an einem magnetischen Abscheidergestell befestigen.

900 Mikroliter Monozytenpuffer zur Äquilibrierung in die Säule geben. Gießen Sie nach der Inkubation die Zellsuspension auf den Filter und lassen Sie sie durch die Schwerkraft in ein Abfallrohr fließen. Fügen Sie einen Milliliter Monozytenpuffer hinzu, um die Säule mit den an magnetische Kügelchen gebundenen Zellen zu waschen.

Ersetzen Sie das Abfallrohr unter der Säule durch ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern RPMI. Geben Sie drei Milliliter Monozytenpuffer in die Säule. Nehmen Sie die Säule aus dem Magnetgestell und befestigen Sie den Stempel.

Drücken Sie die Zellen in das vorbereitete 50 Milliliter Röhrchen und füllen Sie es bis zu 30 Milliliter mit RPMI. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer unter einem Lichtmikroskop und stellen Sie die Zellzahl auf zwei mal 10 ein, um mit RPMI die Leistung von sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen. Säen Sie einen Milliliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Kammer und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Überprüfen Sie nach der Inkubation, ob die Zellen richtig haften, und ersetzen Sie das RPMI durch 1,5 Milliliter Monomedium. Die Inkubation wird bis zu sechs Tage fortgesetzt, bis sich die Monozyten zu Makrophagen differenzieren. Nachdem Sie primäre menschliche Makrophagen aus den Blutproben des Spenders in einer Sechs-Well-Platte gewonnen haben, fügen Sie 500 Mikroliter Accutase hinzu und inkubieren Sie 40 Minuten lang, um die Makrophagen zu lösen.

Fügen Sie dann 500 Mikroliter Medium hinzu und geben Sie es zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Dann waschen Sie die Zellen einmal mit zwei Millilitern DPBS und zählen Sie sie mit einer Neubauer-Kammer. Verdünnen Sie die gewünschte Anzahl von Makrophagen in 40 Mikrolitern Kollagen, das ich mische, und wirbeln Sie das Röhrchen kurz ein.

Um die Sphäroide zu waschen, geben Sie 300 Mikroliter DPBS in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie eine blaue Pipettenspitze von einem Milliliter mit einem abgeschnittenen Ende, um das Steroid mit DPBS aufzufangen. Sobald sich das Steroid in der Spitze abgesetzt hat, schieben Sie die Pipette kurz auf den Boden der Bildgebungskammer, um das Tumorsteroid durch Oberflächenspannung zu übertragen.

Entfernen Sie so viel restliches DPBS wie möglich, das mit dem Steroid übertragen wurde. Geben Sie schnell 40 Mikroliter Kollagen-I-Makrophagenmischung in die Bildgebungskammer, die Steroide enthält. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid unter feuchten Bedingungen, um die Kollagenmischung vollständig zu polymerisieren.

Geben Sie nach der Polymerisation vorsichtig 25 Mikroliter Krebszellmedium in jede Vertiefung und setzen Sie die Inkubation drei Tage lang fort. Bilden Sie die lebende Probe mit einem Laser-Scanning-Mikroskop zu den gewünschten Zeitpunkten ab. Die Sphäroidfläche von H1299 GFP wurde am dritten Tag der Invasion mit 40.307 Quadratmikrometern gemessen, während der Sphäroidumfang 1700,17 Mikrometer betrug, was auf ein Wachstum im Laufe der Zeit hinweist.

Es wurde eine kollektive Invasion von Krebszellen aus dem Sphäroid beobachtet, wobei 51 isolierte Partikel identifiziert wurden, die als Indikator für eine individuelle Invasion von Krebszellen dienen. Das Sphäroid behielt ein Aspektverhältnis von 1,10 und eine Zirkularität von 0,18 bei, was eine geringe Verformung zeigte.