Korrelative optische Spektroskopie und Massenspektrometrie Bildgebungsmethoden zur Visualisierung der Wirkstoffverteilung in einem Weichteilschnitt

Wir entwickeln korrelative spektroskopische Bildgebungsmethoden, um die topische Wirkstoffverabreichung besser zu verstehen. Ziel ist es, neue mechanistische Erkenntnisse über die Permeation von Medikamenten und deren Bioverfügbarkeit innerhalb der Hautschichten zu gewinnen. Diese Informationen werden wertvoll sein, um die Formulierung, das Design und das Dosierungsschema von pharmazeutischen Produkten zu verbessern.

Diese Forschung befasst sich mit dem derzeitigen Mangel an Methoden, um sich gleichzeitig auf der Hautstruktur und der Verteilung von Medikamenten darin zu bilden. Nach topischer Anwendung mit hoher räumlicher Auflösung und hoher Empfindlichkeit. Der Zugang zu solchen Informationen ist für die Entwicklung hochwertiger aktueller Produkte unerlässlich. Dieses Protokoll bietet eine markierungsfreie, schnelle, hochauflösende Visualisierung der Wirkstoffverteilung in der Haut mit hoher chemischer Empfindlichkeit im Vergleich zu bestehenden traditionellen Techniken. All diese Informationen können aus demselben Gewebeschnitt extrahiert werden.

Diese Erkenntnisse verbessern die korrelative Bildgebung, indem sie eine zuverlässige Methode vorstellen, die optische Spektroskopie mit Massenspektrometrie verbindet. Entwickelte Bildregistrierungstechniken gewährleisten eine präzise Ausrichtung des Datensatzes und ermöglichen eine detaillierte Analyse der Wirkstoffverteilung in Geweben. Dieser Fortschritt unterstützt verbesserte topische Wirkstoffverabreichungssysteme und tiefere Einblicke in biologische Wechselwirkungen zwischen Geweben.

Die Forschung wirft wissenschaftliche Fragen darüber auf, wie sich die Formulierung von Hilfsstoffen auf den Wirkstofftransport auswirkt, auf Faktoren, die die Wirkstoffpenetration bei Hauttypen beeinflussen, auf die langfristige Wirkstofffreisetzungs- und Clearance-Kinetik sowie auf die breite Anwendung von Raman- und MSI-korrelativer Bildgebung zur Untersuchung anderer topischer Arzneimittel und anderer Substanzen in Weichgeweben.

[Erzähler] Verwenden Sie für die stimulierte Raman-Streuung oder SRS-Mikroskopie eine Linse mit 40-facher Wasservergrößerung in Verbindung mit einer Luftkondensatorlinse mit kurzem Arbeitsabstand. Platzieren Sie den montierten Hautgewebeschnitt auf dem Probentisch des SRS-Mikroskops und stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe auf derselben Fläche des Objektträgers befindet wie die Kondensorlinse. Fokussieren Sie die Objektivlinse auf den Gewebeschnitt und optimieren Sie dann die Kondensorhöhe. Stellen Sie die Laserleistung auf geeignete Werte ein, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, ohne das Gewebe zu beschädigen. Nehmen Sie als Nächstes ein Mosaikbild des gesamten Gewebeabschnitts auf, das dem CH2-Dehnungsband entspricht. Wählen Sie dann einen Interessenbereich aus und stellen Sie den Bildgebungsparameter auf eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln ein, die einen Bereich von 290 x 290 Mikrometern abdeckt. Verwenden Sie eine Bildgeschwindigkeit von 400 Hertz X1 Zoom und einen Zeilendurchschnitt von eins. Wenden Sie nun konsistente Verstärkungseinstellungen für SRS- und SHG-Fluoreszenzdetektoren an. Nehmen Sie Bilder im CH-Dehnungsbereich bei 2.850 pro Zentimeter auf, was CH2 entspricht. Nehmen Sie dann Bilder im Fingerabdruckbereich bei 1.666 pro Zentimeter auf, was Amid 1 entspricht. Übertragen Sie die Hautprobe nach der SRS-Bildgebung sofort in das ToF-SIMS-Setup. Stellen Sie die negative Ionenpolarität mit einer Tastverhältnis von 100 Millisekunden, einem Massenbereich von 0 bis 900 zu ladenden Massen und einem Strahldurchmesser von fünf Mikrometern ein. Verwenden Sie eine 20-Elektronenvolt-Elektronenflutpistole mit 25 Mikroampere zur Ladungskompensation. Erfassen Sie ein Gesamtbild mit dem Stage-Makro-Raster-Modus, der den gesamten Gewebeschnitt mit einem Sichtfeld in Abhängigkeit von den Gewebeabmessungen abbildet. Als nächstes wird ein Sichtfeld von einem mal 0,5 Millimeter mit vier Aufnahmen pro Pixel pro Bild und 10 Bildern pro Pflaster verwendet, was einer Ionendosis von 1,31 mal 10 hoch 11 Ionen pro Quadratzentimeter entspricht. Nehmen Sie Bilder des interessierenden Bereichs auf, indem Sie das entsprechende Sichtfeld auswählen. Stellen Sie ein Sichtfeld von 0,5 x 0,5 Millimetern mit einer Auflösung von 256 x 256 Pixeln ein. Erfassen Sie eine Aufnahme pro Pixel mit einem Bild pro Scan für insgesamt 15 Scans, was einer Ionendosisdichte von 3,27 mal 10 hoch 10 Ionen pro Quadratzentimeter für die Qualitätskontrolle von Gewebehomogenatproben entspricht. Kalibrieren Sie nach der Aufnahme die resultierenden Massenspektren mit H-, C-, C2- und C3-Ionen. Führen Sie mit der Surface Lab 7.1-Software die Datenerfassung und -extraktion durch. Reduzieren Sie für die Bildregistrierung sowohl SIMS- als auch SRS-Bilder mithilfe der nicht-negativen Matrixfaktorisierung auf drei Dimensionen und visualisieren Sie sie als rote, grüne und blaue Farbkanäle. Wählen Sie mit dem MATLAB-Kontrollpunktauswahlwerkzeug CP Select übereinstimmende Merkmale zwischen den beiden Bildern ohne Matrixfaktorisierung aus. Führen Sie die Registrierung mit den Funktionen CP2 T-Formular und IM-Transformation durch. In einer Feintransformation mit den SIMS-Daten als fixiertem Bild und den optischen Spektroskopiedaten als bewegtem Bild anwenden. Für das Medikament von Interesse, bei dem mehrere Peaks in den ToF-SIMS-Daten nachgewiesen werden, summieren Sie die Intensitäten dieser Peaks, um eine kombinierte Ionenintensität des Wirkstoffs zu erstellen. Extrahieren Sie die durchschnittliche Gesamtionenzahl aus den beiden Homogenatdatensätzen für jede Hautgewebeprobe. Normalisieren Sie mit diesem entsprechenden Wert die ToF-SIMS-Ionenintensitäten des Arzneimittels in jedem Hautbild. Überlagern Sie nach der Registrierung die optische Spektroskopie und die SIMS-Daten, indem Sie die jeweiligen Bilder den RGB-Kanälen zuweisen. In der vorliegenden Studie wurde nach vierstündiger Anwendung des Voltaren-Gels im Vergleich zur mit Placebo behandelten Probe ein erhöhtes Arzneimittelsignal im oberen Bereich der Haut von etwa 50 Mikrometern festgestellt. Nach 16-stündiger Anwendung des Voltaren-Gels dehnte sich das Wirkstoffsignal in tiefere Hautschichten aus, was auf eine verstärkte Gewebepenetration hinweist.