Eine Multi-Elektroden-Array-Plattform zur Modellierung von Epilepsie unter Verwendung von humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Gehirnassembloiden
27. September 2024
Dieses Protokoll zielt darauf ab, dorsal-ventral fusionierte Assembloide auf Mehrelektrodenarrays stabil zu plädieren, um die Epilepsie in vitro zu modellieren.
In den letzten Jahrzehnten hat eine Explosion von Genentdeckungen Hunderte von Genen identifiziert, die Epilepsie verursachen oder mit ihr in Verbindung gebracht werden. Die pathogenen Mechanismen sind jedoch noch nicht so gut erforscht. Unser Labor untersucht, wie sich genetische Veränderungen auf die frühe Gehirnentwicklung auswirken und zu Hirnfehlbildungen und Epilepsie führen, einer schwächenden Krankheit, die durch chronische Anfälle gekennzeichnet ist.
Genetische Epilepsien wurden in der Regel anhand von Tiermodellen untersucht, darunter Mäuse, Zebrafische, Drosophila und Kaninchen. In jüngerer Zeit wurden menschliche Stammzellen zur Modellierung genetischer Epilepsien verwendet, da sich die Techniken zur Differenzierung von Stammzellen in Neurogewebe weiterentwickelt haben. Mit dem Aufkommen von Gehirn-Organoiden können Sie Strukturaspekte der Gehirnentwicklung rekapitulieren.
Die Messung der elektrophysiologischen Aktivität und die Bestimmung von Biomarkern für epilepsiebedingte Aktivität aus Hirnorganoiden und Assembloiden ist eine Herausforderung. Teilweise ist diese Technik eingeschränkt, weil Gehirnorganoide keine Anfälle haben können, wie es bei einem intakten Tier der Fall ist. Nichtsdestotrotz kann das Auffinden elektrophysiologischer Unterschiede in diesem In-vitro-Modell und dem Ansprechen auf medikamentöse Behandlungen dazu beitragen, pathologische Mechanismen und therapeutische Reaktionen bei genetischen Epilepsien zu bestimmen.
Die elektrophysiologische Aktivität kann mit herkömmlichen Patch-Climb-Aufzeichnungen, lokalen Feldaufzeichnungen mit Elektroden und optischen Techniken wie Kalzium- und Speicherspannungsbildgebung beurteilt werden. Die Verwendung von Multielektroden-Array-Aufzeichnungen hat den Vorteil, dass zwei Aufnahmen im Laufe der Zeit gestartet werden können und von mehreren Stellen eines Assembloids gleichzeitig aufgezeichnet werden können.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die stabile Plättierung von dorsoventralen fusionierten Assembloiden auf Multielektrodenarrays (MEAs), um Epilepsie in vitro zu modellieren. Es behandelt die Herausforderungen bei der Messung elektrophysiologischer Aktivität und beim Verständnis der pathologischen Mechanismen genetischer Epilepsien unter Verwendung von aus menschlichen Stammzellen abgeleiteten zerebralen Organoiden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Epilepsieforschung
- Neuroentwicklung
Hintergrund
- Die Entdeckung von Genen hat zahlreiche Gene identifiziert, die mit Epilepsie assoziiert sind.
- Trotz Fortschritten bei der Modellierung sind die pathogenen Mechanismen weiterhin wenig erforscht.
- Menschliche Stammzellen und Gehirnorganoiden haben sich als Modelle zur Untersuchung genetischer Epilepsien etabliert.
- Die Messung neuronaler Aktivität in Organoiden ist im Vergleich zu intakten Tiermodellen begrenzt.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls für die stabile Plättierung von Assembloiden auf MEAs.
- Untersuchung der elektrophysiologischen Unterschiede, die in den In-vitro-Modellen beobachtet wurden.
- Beurteilung der Reaktionen auf pharmakologische Behandlungen bei der Modellierung genetischer Epilepsien.
Verwendete Methoden
- Nutzung von Multielektrodenarrays (MEAs) für elektrophysiologische Ableitungen.
- Modellierung mit dorso-ventral verschmolzenen Assembloiden, die aus menschlichen Stammzellen stammen.
- Kritische Schritte umfassen die Vorbehandlung der MEA-Oberfläche, die Vorbereitung der Vertiefungen und das Platzieren der Assembloide.
- Beobachtung der neuronalen Reifung über die Zeit unter Einschätzung der Netzwerkaktivität.
Hauptergebnisse
- Die Dauer des Netzwerk-Feuerns nahm mit der Reifung der Neuronen zu.
- Veränderungen der zellulären und Netzwerkaktivität wurden über die Zeit verfolgt und gingen letztlich bis zum Tag 125 zurück.
- Die Untersuchung der Arzneimittelwirkungen könnte helfen, die pathologischen Mechanismen der Epilepsie aufzudecken.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine robuste Methode zur Modellierung von Epilepsie in vitro mithilfe von Assembloiden auf MEAs bereit.
- Die Ergebnisse ermöglichen detaillierte Untersuchungen der Pathologie und der Behandlungsreaktionen genetischer Epilepsien.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten das Verständnis der mit Epilepsie assoziierten neuronalen Mechanismen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Auf Mehrfachelektrodenarrays (MEAs) kultivierte, aus menschlichen pluripotenten Stammzellen stammende Gehirn-Assembloide ermöglichen die longitudinale, nicht destruktive Messung neuronaler Netzwerkaktivität, die für Epilepsie relevant ist. Diese Plattform schließt die Lücke zwischen genetischer Entdeckung und mechanistischem Verständnis, indem sie ein skalierbares, menschenspezifisches System für die funktionelle Untersuchung und die Profilierung der Arzneimittelwirkung bereitstellt. Der Ansatz unterstützt eine vorhersagekräftige Zuversicht bei der Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und leitet risikoadjustierte Portfolioentscheidungen für die Entwicklung von Neurotherapeutika ein.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Beurteilung genetischer Varianten, die mit Epilepsie in Verbindung gebracht werden, unter Verwendung menschlich gewonnener neuronaler Schaltkreise.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Aufdeckung phänotypischer Veränderungen auf Netzwerkebene und abnormer Aktivitätsmuster.
- Erleichtert die hypothesengeleitete Untersuchung der Integration erregender und hemmender Neuronen.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung des Einflusses potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf krankheitsrelevante Netzwerkdynamiken.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht einen robusten, longitudinalen elektrophysiologischen Assay zur Quantifizierung der Netzwerkaktivität über längere Zeiträume.
- Ermöglicht die reproduzierbare Messung von Feldpotentialen, Spikes und Burst-Mustern in mehreren Assembloiden.
- Ermöglicht eine standardisierte Herstellung komplexer 3D-neuraler Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoffprüfung.
- Erleichtert die skalierbare, multiplexe Datenerfassung zur vergleichenden Analyse von Arzneimittelwirkungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt in-vitro-Netzwerkphänotypen mit krankheitsrelevanten Biomarkern für die Epilepsieforschung.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der genetischen Entdeckung zur präklinischen Validierung in einem menschenspezifischen Kontext.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung neurotherapeutischer Kandidaten basierend auf funktionellen Messgrößen.
- Ermöglicht die mechanistische Bewertung therapeutischer Interventionen in einem kontrollierten, skalierbaren System.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese auf MEA basierende Assembloid-Plattform verbindet die frühe Entdeckungsforschung mit der präklinischen Forschung, indem sie die funktionelle Zielvalidierung, die Assay-Entwicklung und die translationale Biomarker-Abstimmung in der Modellierung von Epilepsie ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung und die mechanistische Entschärfung von Risiken, indem netzwerkebene Effekte genetischer oder pharmakologischer Störungen quantifiziert werden.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative elektrophysiologische Messwerte, die für die Bewertung von Substanzen und die Standardisierung von Assays geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht die longitudinale Messung von Netzwerk-Feuern, Reifung und Arzneimittelwirkung für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Korrelatiert In-vitro-Phänotypen mit Krankheitsmechanismen und unterstützt biomarkerbasierte präklinische Entscheidungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, anpassbare Plattform zur Modellierung unterschiedlicher Hirnregionen und neurologischer Erkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und verringert mechanistische Unschärfen in der Epilepsieforschung.
- Operationaler Wert: Standardisiert komplexe neuronale Assays hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene F&E-Teams hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung bezüglich Projektfortführung oder -abbruch und die Kapitalnutzungseffizienz, indem funktionelle humane Daten frühzeitig in der Entwicklungsphase bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung neurotherapeutischer Assets auf Grundlage belastbarer funktioneller Evidenz.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Differenzierung von Stammzellen, der Kultur von Organoiden und dem Aufbau elektrophysiologischer Assays.
- Setzt Zugang zu Multielektroden-Array-Systemen und analytischer Infrastruktur für die datenreiche Datenaufnahme voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Ansaat, Pflege und Analyseprotokollen.
- Kann auf verschiedene, spezifische zerebrale Organoidtypen angepasst werden, erfordert jedoch möglicherweise Optimierungen für unterschiedliche Gewebetypen.
- Die Stabilität der Langzeitkultur und -aufzeichnung ist entscheidend für verlässliche longitudinale Studien.
