Eine Multi-Elektroden-Array-Plattform zur Modellierung von Epilepsie unter Verwendung von humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Gehirnassembloiden
27. September 2024
Dieses Protokoll zielt darauf ab, dorsal-ventral fusionierte Assembloide auf Mehrelektrodenarrays stabil zu plädieren, um die Epilepsie in vitro zu modellieren.
In den letzten Jahrzehnten hat eine Explosion von Genentdeckungen Hunderte von Genen identifiziert, die Epilepsie verursachen oder mit ihr in Verbindung gebracht werden. Die pathogenen Mechanismen sind jedoch noch nicht so gut erforscht. Unser Labor untersucht, wie sich genetische Veränderungen auf die frühe Gehirnentwicklung auswirken und zu Hirnfehlbildungen und Epilepsie führen, einer schwächenden Krankheit, die durch chronische Anfälle gekennzeichnet ist.
Genetische Epilepsien wurden in der Regel anhand von Tiermodellen untersucht, darunter Mäuse, Zebrafische, Drosophila und Kaninchen. In jüngerer Zeit wurden menschliche Stammzellen zur Modellierung genetischer Epilepsien verwendet, da sich die Techniken zur Differenzierung von Stammzellen in Neurogewebe weiterentwickelt haben. Mit dem Aufkommen von Gehirn-Organoiden können Sie Strukturaspekte der Gehirnentwicklung rekapitulieren.
Die Messung der elektrophysiologischen Aktivität und die Bestimmung von Biomarkern für epilepsiebedingte Aktivität aus Hirnorganoiden und Assembloiden ist eine Herausforderung. Teilweise ist diese Technik eingeschränkt, weil Gehirnorganoide keine Anfälle haben können, wie es bei einem intakten Tier der Fall ist. Nichtsdestotrotz kann das Auffinden elektrophysiologischer Unterschiede in diesem In-vitro-Modell und dem Ansprechen auf medikamentöse Behandlungen dazu beitragen, pathologische Mechanismen und therapeutische Reaktionen bei genetischen Epilepsien zu bestimmen.
Die elektrophysiologische Aktivität kann mit herkömmlichen Patch-Climb-Aufzeichnungen, lokalen Feldaufzeichnungen mit Elektroden und optischen Techniken wie Kalzium- und Speicherspannungsbildgebung beurteilt werden. Die Verwendung von Multielektroden-Array-Aufzeichnungen hat den Vorteil, dass zwei Aufnahmen im Laufe der Zeit gestartet werden können und von mehreren Stellen eines Assembloids gleichzeitig aufgezeichnet werden können.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die stabile Plättierung dorsoventral verschmolzener Assembloide auf Multielektrodenarrays (MEAs) zur Modellierung von Epilepsie in vitro. Es behandelt die Herausforderungen bei der Messung elektrophysiologischer Aktivität und beim Verständnis der pathologischen Mechanismen genetischer Epilepsien unter Verwendung von aus menschlichen Stammzellen abgeleiteten Gehirnorganoiden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Epilepsieforschung
- Neuroentwicklung
Hintergrund
- Genetische Entdeckungen haben zahlreiche Gene identifiziert, die mit Epilepsie assoziiert sind.
- Die pathogenen Mechanismen sind trotz Fortschritten bei der Modellierung weiterhin unzureichend erforscht.
- Menschliche Stammzellen und Gehirnorganoiden haben sich als Modelle zur Untersuchung genetischer Epilepsien etabliert.
- Die Messung neuronaler Aktivität in Organoiden ist im Vergleich zu intakten Tiermodellen begrenzt.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll für die stabile Plättierung von Assembloiden auf MEAs etablieren.
- Die beobachteten elektrophysiologischen Unterschiede in den In-vitro-Modellen untersuchen.
- Die Reaktionen auf pharmakologische Behandlungen bei der Modellierung genetischer Epilepsien bewerten.
Verwendete Methoden
- Nutzung von Multielektrodenarrays (MEAs) für elektrophysiologische Ableitungen.
- Modellierung mit dorsoventral fusionierten Assembloiden, die aus humanen Stammzellen abgeleitet sind.
- Kritische Arbeitsschritte umfassen die Vorbehandlung der MEA-Oberfläche, die Vorbereitung der Vertiefungen und das Platzieren der Assembloide.
- Beobachtung der neuronalen Reifung über die Zeit unter Einschluss von Bewertungen der Netzwerkaktivität.
Hauptergebnisse
- Es wurde eine verlängerte Dauer des Netzwerk-Feuerns während der Reifung der Neuronen beobachtet.
- Änderungen der zellulären und netzwerkweiten Aktivität wurden über die Zeit verfolgt und gingen letztendlich bis zum Tag 125 zurück.
- Die Untersuchung von Arzneimittelwirkungen könnte dazu beitragen, die pathologischen Mechanismen der Epilepsie aufzuklären.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine robuste Methode zur Modellierung von Epilepsie in vitro mithilfe von Assembloiden auf MEAs bereit.
- Die Ergebnisse ermöglichen detaillierte Untersuchungen zur Pathologie und Behandlungsreaktionen genetischer Epilepsien.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten das Verständnis der mit Epilepsie assoziierten neuronalen Mechanismen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Humane pluripotente Stammzellen-abgeleitete Hirn-Assembloide, die auf Multielektrodensystemen (MEAs) kultiviert werden, ermöglichen die langzeitliche, nicht-invasive Messung der neuronalen Netzwerkaktivität im Kontext der Epilepsie. Diese Plattform schließt die Lücke zwischen genetischer Entdeckung und mechanistischem Verständnis, indem sie ein skalierbares, menschenspezifisches System für die funktionelle Untersuchung und Profilierung der Arzneimittelwirkung bereitstellt. Die Methode unterstützt eine verlässliche Vorhersage bei der frühen Validierung von Zielstrukturen und trägt zur risikoadjustierten Entscheidungsfindung in der Entwicklung von Neurotherapeutika bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Beurteilung genetischer Varianten, die mit Epilepsie in Verbindung gebracht werden, unter Verwendung menschlich stammender neuronaler Schaltkreise.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Aufdeckung phänotypischer Veränderungen auf Netzwerkebene und abnormer Aktivitätsmuster.
- Erleichtert die hypothesengeleitete Untersuchung der Integration erregender und hemmender Neuronen.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung des Einflusses potenzieller therapeutischer Maßnahmen auf krankheitsrelevante Netzwerkdynamiken.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht einen robusten, longitudinalen elektrophysiologischen Assay zur Quantifizierung der Netzwerkaktivität über längere Zeiträume.
- Erlaubt die reproduzierbare Messung von Feldpotentialen, Spikes und Burst-Mustern in mehreren Assembloiden.
- Ermöglicht die standardisierte Herstellung komplexer 3D-neuraler Systeme für anschließende Wirkstofftests.
- Erleichtert skalierbare, multiplexe Datenerfassung zur vergleichenden Analyse von Arzneimittelwirkungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt in-vitro-Netzwerkphänotypen mit krankheitsrelevanten Biomarkern für die Epilepsieforschung.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der genetischen Entdeckung zur präklinischen Validierung in einem menschenspezifischen Kontext.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung neurotherapeutischer Kandidaten basierend auf funktionellen Messgrößen.
- Ermöglicht die mechanistische Bewertung therapeutischer Interventionen in einem kontrollierten, skalierbaren System.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese auf MEA basierende Assembloid-Plattform verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Forschung, indem sie die funktionelle Target-Validierung, die Assay-Entwicklung und die translationale Biomarker-Abstimmung in der Epilepsiemodellierung ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung und die mechanistische Risikominderung durch Quantifizierung netzwerkebeneffekte genetischer oder pharmakologischer Störungen.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative elektrophysiologische Ergebnisse, die für die Bewertung von Substanzen und die Standardisierung von Assays geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht die longitudinale Messung von Netzwerk-Feuern, Reifung und Arzneimittelwirkung für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung Korrelatiert In-vitro-Phänotypen mit Krankheitsmechanismen und unterstützt biomarkerbasierte präklinische Entscheidungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, anpassbare Plattform zur Modellierung unterschiedlicher Hirnregionen und neurologischer Erkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung und verringert mechanistische Unschärfen in der Epilepsieforschung.
- Operationaler Wert: Standardisiert komplexe neuronale Assays hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Forschungs- und Entwicklungsteams hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitalnutzungseffizienz, indem funktionelle humane Daten frühzeitig in der Entwicklungsphase bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung neurotherapeutischer Assets auf Grundlage belastbarer funktioneller Nachweise.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Differenzierung von Stammzellen, Kultur von Organoiden und dem Aufbau elektrophysiologischer Assays.
- Benötigt Zugang zu Multielektrodenarray-Geräten und analytischer Infrastruktur für die Erfassung datenreicher Messungen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Zellansaat, Kulturpflege und Datenanalyse voraus.
- Kann auf verschiedene, spezifische Hirnregionen betreffende Organoiden angepasst werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für unterschiedliche Gewebetypen.
- Die Stabilität von Langzeitkulturen und -aufzeichnungen ist entscheidend für verlässliche Längsschnittstudien.
