Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen

Daher untersuchen wir komplexe Kohlenhydrate oder Glykane im angeborenen Immunsystem und immunbedingte Störungen, wobei wir uns derzeit auf Sepsis und Krebs konzentrieren. Unsere Arbeit umfasst analytische Methoden und Systeme der Glykobiologie, einschließlich Glykomik und Glykoproteomik-Methoden, zur detaillierten Charakterisierung des humanen Glykoproteins. Die Glykoproteomik hat in den letzten Jahrzehnten enorme Fortschritte gemacht, und der Fortschritt ist nicht mehr durch den Mangel an qualitativ hochwertigen Massenspektrometriedaten begrenzt.

Vielmehr besteht die Herausforderung darin, biologisches Wissen aus den spektralen Daten zu interpretieren und zu generieren. Die Glykoproteomik-gesteuerte Glykoproteomik-Methode ermöglicht es Glykowissenschaftlern, einen tiefen und genauen Einblick in das Glykoproteom und die harten Barrieren mit menschlichen Gesundheitsindizes zu erhalten. Die Glykoproteomik ist in einzigartiger Weise in der Lage, ortsspezifische Einblicke in das Glykoproteom zu generieren. Aber die Glykopeptidraten bleiben hoch.

Um diese Reproduzierbarkeitsprobleme zu lösen, ermöglicht unsere Glykomologie-Glykoproteomics-Methode eine präzise Erstellung von Glykoproteom-Profilen, indem Einschränkungen im Glykansuchraum durch die Glykomik-Untersuchung derselben Probe definiert werden. Letztendlich ermöglicht es eine schnellere und genauere Suche nach Glykopeptiden. Unsere Glykoproteomik-gesteuerte Glykoproteomics-Methode ermöglicht eine umfassende Kartierung der Heterogenität und Dynamik der Glykoproteom-Indizes aus einer Vielzahl unterschiedlicher humaner Proben.

Diese Methode kann uns daher helfen, den Krankheitsverlauf besser zu verstehen und neue diagnostische Biomarker für therapeutische Ziele gegen eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten zu finden. Die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik-Methode ermöglicht es uns, die Komplexität des menschlichen Glykoproteoms zu entschlüsseln, was wiederum neue biologische Fragen aufwirft, z. B. wie Glykanstrukturen die Proteinfunktion, die Zellkommunikation oder Immunreaktionen beeinflussen. Es stellt sich auch die Frage, wie und warum sich das Glykosylierungsmuster bei bestimmten Krankheiten verändert hat.

Und diese Erkenntnisse könnten zu Entdeckungen, neuen diagnostischen Markern und personalisierten Therapien bei komplexen Krankheiten führen. Um das Protein von Interesse auf einer PVDF-Membran mit einer Einlochpunktion zu immobilisieren, schneiden Sie die Membran basierend auf der Anzahl der zu entdeckenden Proben. Befeuchten Sie die herausgeschnittenen Membranen mit Methanol und geben Sie sie dann auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden.

Sobald die Membranen fast trocken sind, geben Sie 2,5 Mikroliter Proteinproben pro Spot. Trocknen Sie die Membranen mindestens drei Stunden lang oder vorzugsweise über Nacht bei 20 bis 25 Grad Celsius an der Luft, wobei darauf zu achten ist, dass keine Kontamination erfolgt. Geben Sie 100 Mikroliter 1%PDP-40 in Methanol in jede Vertiefung, die die gefleckten Membranen enthält.

Schütteln Sie die Platte in der PDP-40-Lösung bei 20 bis 25 Grad Celsius. Verwerfen Sie die PDP-40-Lösung nach fünf Minuten. Waschen Sie anschließend jede Vertiefung mit den blockierten Proteinflecken mit 100 Mikrolitern Reinstwasser und schütteln Sie die Platte fünf Minuten lang.

Geben Sie 15 Mikroliter PNGase F-Lösung in jede Vertiefung. Um Austrocknung zu verhindern, geben Sie Wasser in die umliegenden leeren Brunnen. Verschließen Sie die Platte vorsichtig mit Klarsichtfolie und inkubieren Sie sie mindestens acht Stunden bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation beschallen Sie die Platte fünf Minuten lang, damit sich verdunstete Tröpfchen an den Seiten der Vertiefungen am Boden sammeln können. Die freigesetzten N-Glykan-Proben werden in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Waschen Sie jede Probe zweimal gut mit 20 Mikrolitern Reinstwasser und saugen Sie alle verbleibenden Proben an und kombinieren Sie sie in die neuen Röhrchen.

Fügen Sie anschließend 10 Mikroliter 100-Millimolares Ammoniumacetat pH 5 hinzu und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 20 bis 25 Grad Celsius. Trocknen Sie die N-Glykan-Proben in einem Vakuumkonzentratorsystem. Um hausgemachten porösen Graphitkohlenstoff oder PGC-C18-Festphasenextraktion oder SPE-Mikrosäulen herzustellen, verwenden Sie eine Spritze, um C18-Scheiben zu verstopfen und in 10-Mikroliter-Pipettenspitzen zu übertragen.

Pipettieren Sie einen 10 Mikroliter PGC-Harzschlamm, der in 50 % Methanol suspendiert ist, in die C18 SPE-Mikrosäulen. Setzen Sie die Mikrosäulen in 2-Milliliter-Röhrchen mit Mikrozentrifugenadaptern ein. Schleudern Sie die Röhrchen, um PGC-C18 SPE-Mikrosäulen mit einer ungefähren Säulenhöhe von 0,5 Zentimetern herzustellen.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter 0,1 %ige Trifluoressigsäure (TFA) in Acetonitril in die Mikrosäulen und zentrifugieren Sie sie 60 Sekunden lang bei 2000 g, um den Durchgang der mobilen Phasen durch die Mikrosäulen zu erleichtern. Waschen und konditionieren Sie die Mikrosäulen auf ähnliche Weise dreimal mit 0,1 % wässrigem TFA. Die N-Glykan-Proben werden in Beladungsvolumina von bis zu 40 Mikrolitern auf jede Mikrosäule aufgetragen.

Drehen Sie die Mikrosäule nach jeder Ausgabe und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Probe geladen ist. Waschen Sie jede Mikrosäule mit 20 Mikrolitern Reinstwasser. Übertragen Sie die Mikrosäulen in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Um die N-Glykane zu eluieren, geben Sie 40 Mikroliter 0,1 % TFA in 50 % Acetonitril in jede Mikrosäule. Drehe die Röhrchen und vermische das Eluat aus jedem Spin. Trocknen Sie die entsalzten N-Glykane in einem Vakuumkonzentratorsystem.

Durchsuchen Sie die generierten LC-MS/MS-Rohdaten mit entsprechender Software. Bestätigen Sie eine hohe Datenqualität durch die Bewertung der schmalen LC-Peakbreite, der effektiven Trennung von N-Glykan-Isomeren, der hohen MS-Genauigkeit, der Auflösung und des Signal-Rausch-Verhältnisses sowie der hohen CID MS/MS-Fragmentierungseffizienz. Manuelle Identifizierung von N-Glykanen in der Probe auf der Grundlage der monoisotopischen Vorläufermasse, der CID MS/MS-Fragmentierungsmuster sowie der relativen und absoluten PGC-LC-Retentionszeiten.

Für die relative Quantifizierung von N-Glykanen erstellen Sie eine Übergangsliste, die das Verhältnis von Masse zu Ladung von Monoisotopenvorläufern für alle identifizierten N-Glykan-Isomere enthält. Bestimmen Sie die Flächenwerte unter der Kurve aus extrahierten Ionenchromatogrammen aller N-Glykan-Vorläuferionen. Zur Herstellung von ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäulen die C8-Scheiben mit einer Spritze verstopfen und in 10-Mikroliter-Pipettenspitzen übertragen.

Eine Aufschlämmung aus in Methanol suspendiertem ZIC-HILIC-Harz wird in die C8-SPE-Mikrosäulen gegeben. Platzieren Sie die Mikrosäulen in 2-Milliliter-Röhrchen mit Mikrozentrifugenadaptern und stellen Sie sicher, dass die Säulen in der Mitte aufgehängt sind. Durch Drehen entstehen C8-SPE HPLC-Mikrosäulen mit einer ungefähren Höhe von einem Zentimeter.

Geben Sie 50 Mikroliter Methanol in die Mikrosäulen und zentrifugieren Sie sie 60 Sekunden lang bei 2000 G, so dass die mobilen Phasen die Säule passieren können. Waschen Sie die Mikrosäulen auf ähnliche Weise dreimal mit jeweils 50 Mikrolitern Reinstwasser, gefolgt von 50 Mikrolitern 1 % TFA in 80 % Acetonitril. Die getrockneten Peptidmischungen, die für die N-Glykopeptid-Anreicherung bestimmt sind, in 50 Mikroliter 1 % TFA in 80 % Acetonitril resuspendieren und gründlich mischen.

Setzen Sie den Zustand ZIC-HILIC-C8-SPE Mikrosäulen in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Mikrozentrifugenadaptern ein. Tragen Sie die resuspendierten Peptidmischungen auf jede Mikrosäule auf und drehen Sie sie 60 Sekunden lang bei 2000 g. Sammeln Sie den Durchfluss der Fraktionen und tragen Sie jede Fraktion erneut auf dieselbe ZIC-HILIC-C8-SPE-Mikrosäule auf.

Dann eluieren Sie das N-Glykopeptid mit der sequentiellen Zugabe von 50 Mikrolitern 25-millimolarem Ammoniumbicarbonat und 50 Mikrolitern 50% Acetonitril. Übertragen Sie die Mikrosäulen in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Um das zurückgehaltene N-Glykopeptid sequentiell zu eluieren, geben Sie 50 Mikroliter 0,1 % wässriges TFA in die Mikrosäulen und zentrifugieren Sie es 60 Sekunden lang bei 2000 g.

Dann eluieren Sie das N-Glykopeptid mit der sequentiellen Zugabe von 50 Mikrolitern 0,1 % wässrigem TFA, gefolgt von 50 Mikrolitern 25-millimolarem Ammoniumbicarbonat und 50 Mikrolitern 50 % Acetonitril. Sammeln, kombinieren und trocknen Sie die angereicherten N-Glykopeptide und das nicht modifizierte Peptid fließen durch die Fraktionen in einem Vakuumkonzentratorsystem. Bei der Analyse der N-Glykomics-Daten wurden 76 N-Glykan-Isomere in kolorektalen Krebsgeweben mit 70 % Komplex-/Hybridglykanen, 20 % Oligomannose und 10 % Paucimannose identifiziert.

Alle N-Glykan-Strukturen wurden mit spektralen Beweisen bestätigt, die anhand von Flächenwerten unter der Kurve aus extrahierten Ionenchromatogrammen quantifiziert wurden.