Name: Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Lernen Sie Einzelzell-Calcium-Imaging mit Fura-2/AM zur Untersuchung von TRPV1-Kanälen und thermischer Schmerzwahrnehmung in Keratinozyten und HEK293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring intrazellulärer Calcium-Signale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Einzelzell-Calcium-Imaging für Kanalaktivierungsstudien

<ol><li>Murthy, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+for+contraction+and+relaxation+in+smooth+muscle+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut.</a> Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).</li>
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<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+analysis+of+stim1+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation.</a> Cells. 12 (22), 2613(2023).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+safeguards+organelle+homeostasis+and+cellular+aging+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells.</a> Cell Discov. 4, 2(2018).</li>
<li>Jiang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+piezo1+channel+mediates+heart+mechano-chemo+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction.</a> Nat Commun. 12 (1), 869(2021).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Orai1-mediated+store-operated+Ca%282%2B%29+channel%2Fcalpain+signaling+contributes+to+high+glucose-induced+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury.</a> J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+er+ion+homeostasis+maintained+by+an+er+anion+channel+clcc1+contributes+to+als-like+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies.</a> Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).</li>
<li>Gouin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv1+and+trpa1+in+cutaneous+neurogenic+and+chronic+inflammation%3A+Pro-inflammatory+response+induced+by+their+activation+and+their+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization.</a> Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+fura-2+am%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am.</a> J Vis Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lever-like+transduction+pathway+for+long-distance+chemical-+and+mechano-gating+of+the+mechanosensitive+piezo1+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel.</a> Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsaicine</td><td>Sigma</td><td>211275</td><td></td></tr><tr><td>CL-100 Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonsäure (CPA)</td><td>Sigma</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 Licht</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Bildgebungssoftware (MetaFluor, kostenpflichtige Software)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Puffer</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20 Heiz-/Kühlgerät für Flüssigkeitszirkulation</td><td>Harvard Apparatur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weißlichtquelle</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzelzell-calcium-imaging zur untersuchung der aktivierung von calcium-ionenkanälen

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Erkennung des Temperaturverhaltens 
Primärer Keratinozyten Primäre Keratinozyten wurden aus neugeborenen Mäusen isoliert und gemäß den etablierten Protokollen10 präpariert. Diese Zellen wurden in 24-Well-Platten mit Glasobjektträgern ausgesät. Nach dem Laden der Fura-2-Sonde wurde der Fokus unter dem Mikroskop bei einer Wellenlänge von 380 nm eingestellt, um eine klare Visualisierung der Zellmorphologie zu erreichen, wie in Abbildung 2A dargestellt. Wenn die Sonde während des Prozesses nicht erfolgreich geladen wurde, waren die Zellen nicht sichtbar. Der extrazelluläre Puffer in der Kammer wurde kontinuierlich durch ein Perfusionssystem ersetzt, wodurch optimale Bedingungen für die Zellen gewährleistet wurden. Das Temperaturkontrollsystem war mit dem Perfusionssystem verbunden und ermöglichte die Detektion zellulärer thermischer Reaktionen durch Kontrolle von Temperaturänderungen im extrazellulären Puffer. Bei diesem Prozess wurde der extrazelluläre Puffer allmählich erhitzt und dann allmählich abgekühlt.
Das einzellige Ca2+ -Bildgebungssystem wurde verwendet, um Veränderungen der intrazellulärenCa2+ -Konzentration unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu überwachen. Wie in Abbildung 2B gezeigt, zeigten Keratinozyten eine ausgeprägte thermische Reaktion, wenn sie Erwärmung ausgesetzt wurden, sowie eine auffällige Reaktion während der Abkühlphase. Bemerkenswert ist, dass diese Temperaturreaktion verschwand, als das STIM1-Gen, das hauptsächlich für diese Reaktion verantwortlich ist, gelöscht wurde (Abbildung 2C)10. Die Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung ermöglicht die Beobachtung von Echtzeit-Änderungen der intrazellulären Ca2+ -Konzentration als Reaktion auf verschiedene externe Reize und ermöglicht so eine detaillierte Analyse des zellulären Verhaltens und der Signalübertragung.
HEK293T Zellen, die die Zielplasmide überexprimieren HEK293T Zellen wurden nach der experimentellen Methode in eine 24-Well-Platte mit Glasobjektträgern ausgesät. Die Zellen wurden dann mit STIM1/Orai1 überexprimiert, und ihre vermittelte thermische Reaktion wurde mit der gleichen Methode wie oben beschrieben für Primärzellen nachgewiesen. Im Falle von Zellen, die das Zielplasmid überexprimierten, wurde die erfolgreiche Transfektion durch Selektion von Zellen bestätigt, die das entsprechende Plasmid exprimierten, was durch rot oder grün fluoreszierende Proteine angezeigt wurde, die vom Plasmid unter TRITC- oder FITC-Wellenlängen getragen wurden. Für dieses Experiment wurden STIM1-GFP/Orai1-DsRed-Plasmide verwendet, wobei GFP unter FITC nachgewiesen wurde und grüne Fluoreszenz emittierte, und DsRed unter TRITC mit roter Fluoreszenz detektiert wurde. Zellen, die leere mCherry (TRITC) überexprimieren, wurden als Negativkontrollen verwendet. Wie in Abbildung 3A gezeigt, zeigten Fluoreszenzzellen, die unter FITC beobachtet wurden, eine erfolgreiche Expression von STIM1, was die Auswahl und Aufzeichnung ihrer thermischen Reaktion während des Heiz- und Kühlprozesses ermöglicht. Zellen, die nicht transfiziert wurden, dienten als Negativkontrolle. Abbildung 3B zeigt, dass STIM1/Orai1 während des Abkühlprozesses eine signifikante thermische Reaktion zeigte, im Gegensatz zu der in Abbildung 3C gezeigten Negativkontrolle.
Erkennung von Arzneimittelreaktionen Die Einzelzell-Ca2+ -Bildgebungstechnologie kann auch verwendet werden, um Zellreaktionen auf Verbindungen zu erkennen. Die Zellvorbereitung für die Detektion thermischer Reaktionen ist die gleiche wie oben beschrieben. Der Unterschied zwischen Wirkstoffreaktion und thermischer Reaktion liegt in der Tatsache, dass die thermische Reaktion in der Regel die Aktivierung von Zellen durch Änderung der Temperatur des extrazellulären Puffers durch ein Perfusionssystem erfordert, während Verbindungen entweder durch Perfusion oder durch direkte Zugabe mit einer Pipette verabreicht werden können. Durch die direkte Zugabe mit einer Pipette kann die Menge der verwendeten Verbindung effektiv eingespart werden. Die resultierende Kurve ist jedoch möglicherweise nicht immer optisch so ansprechend wie die durch Perfusion erhaltene.
Am Beispiel von Abbildung 4 zeigt Abbildung 4A die SOCE-Reaktion (Store-Operated Calcium Entry) von STIM1/Orai1, bei der die extrazelluläreCa2+ -Konzentration und der Gehalt an Cyclopiazonsäure (CPA) sequentiell durch ein Perfusionssystem verändert werden, um SOCE zu induzieren. In Abbildung 4B wird der TRPV1-Agonist Capsaicin mit einer Pipette direkt zu Zellen hinzugefügt, die das TRPV1-Plasmid überexprimieren. Capsaicin kann TRPV1 aktivieren und den extrazellulären Ca2+ -Einstrom induzieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg">
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Fura-2 AM. Fura-2 ist eine in der Zellbiologie häufig verwendete Ca2+ -Fluoreszenzsonde, die selektiv im Verhältnis 1:1 an Ca2+ bindet und Fluoreszenz emittiert. Aufgrund seiner hochpolaren Natur als saure Verbindung kann Fura-2 nicht in Zellen eindringen. Um die Zellpermeabilität zu erhöhen, wird es an seiner negativen Gruppe mit Acetoxymethyl (AM) konjugiert, um Fura-2/AM zu bilden. Diese Modifikation erhöht die Löslichkeit des Esters und eliminiert die negative Ladung. In den Zellen wird Fura-2/AM durch Esterasen zu Fura-2 hydrolysiert, das reversibel an freies zytoplasmatisches Ca2+ binden kann. Bei der Bindung verschiebt sich die maximale Anregungswellenlänge von 380 nm auf 340 nm (bei Sättigung mit Ca2+). Die emittierte Fluoreszenzintensität hängt quantitativ mit der Konzentration des gebundenen Ca2+ zusammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Detektion der Temperaturreaktion von primären Keratinozyten. (A) Fura-2-Färbung von Keratinozyten aus neugeborenen Mäusen, beobachtet unter einer 20-fachen Objektivlinse. (B,C) Temperaturreaktion von WT-Keratinozyten (B) und STIM1-Knockout-Keratinozyten (C) unter Verwendung eines einzelligen Ca2+ -Bildgebungssystems. Vergrößerung: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Temperaturerkennung von STIM1-GFP/Orai1-Dsred in HEK293T Zellen. (A) Eine repräsentative Abbildung mit positiven Zellen, die STIM1-GFP unter FITC exprimieren. (B,C) Temperaturreaktion von HEK293T Zellen, die das jeweilige Plasmid exprimieren, das mit einem einzelligen Ca2+ -Bildgebungssystem detektiert wurde. Vergrößerung: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Nachweis des Wirkstoffansprechens mittels Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung. (A) SOCE-Reaktion von HEK293T Zellen, die STIM1/Orai1 überexprimieren. Der extrazelluläre Puffer wird mit Hilfe eines Perfusionssystems von Ca2+-haltig auf Ca2+-frei umgestellt. In Abwesenheit von Ca2+ wird CPA zugesetzt, um Ca2+ aus dem endoplasmatischen Retikulum zu depletieren. Der extrazelluläre Puffer wird dann durch einen Ca2+-haltigen Puffer ersetzt, um den extrazellulären Ca2+ -Einstrom zu induzieren, was den speicherbetriebenen Ca2+ -Eintritt darstellt. Die Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung wird verwendet, um die durch diese Prozesse induzierten Änderungen der zytosolischenCa2+ -Konzentration dynamisch aufzuzeichnen. (B) HEK293T Zellen, die TRPV1-mRuby überexprimieren, wobei mRuby ein fluoreszierendes Protein ist, das zur Überprüfung des Transfektionszustands des TRPV1-Proteins verwendet wird. Capsaicin wird mit einer Pipette zugegeben, während der Ca2+ -Einstrom durch Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung aufgezeichnet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

single-cell-calcium-imaging-for-studying-activation-calcium-ion

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

Dieses Video stellt die Konzepte hinter der Kalziumbildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll für die Zeitrafferbildgebung von Würmern, die in geformten Agarose-Vertiefungen enthalten sind.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Die Zellkalziumbildgebung ist eine vielseitige Methodik zur Untersuchung der dynamischen Signalgebung einzelner Zellen, an gemischten Populationen in Kultur oder sogar an erwachten Tieren, basierend auf der Expression von kalziumdurchlässigen Kanälen / Rezeptoren, die einzigartige funktionelle Signaturen ergeben.

Visualisierung von Verschiebungen auf dem Neuron-Glia-Schaltkreis mit der Kalzium-Bildgebungstechnik

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) ermöglichen eine robuste Analyse der sensorischen Neuronensignalisierung auf Populationsebene. Hier haben wir einen neuartigen Ansatz entwickelt, der eine in vivo GECI-Visualisierung der Aktivität von Trigeminusganglien bei Ratten ermöglicht.

In-vivo Kalzium-Bildgebung von sensorischen Neuronen im Trigeminusganglion der Ratte

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Verfügung, um anfängliche lokale Ca2+ -Signale, sogenannte Ca2+ -Mikrodomänen, in primären murinen und humanen T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie aufzuklären. Dieses Protokoll dient als wertvolle Ressource für Forscher, die die Ca2+ -Signalwege in Immunzellen untersuchen und ihre Funktion weiter entschlüsseln können.

Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Lernen Sie Einzelzell-Calcium-Imaging mit Fura-2/AM zur Untersuchung von TRPV1-Kanälen und thermischer Schmerzwahrnehmung in Keratinozyten und HEK293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring intrazellulärer Calcium-Signale.

Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

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