Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Wir untersuchten unsere Kanäle in Bezug auf das Temperaturempfinden, das Altersempfinden und das Schmerzempfinden. Wir interessieren uns für das Screening der Aktivitäten kleiner Moleküle in unseren Kanälen und die Untersuchung ihrer Mechanismen. Wir haben zwei TRPV1-aktivierende Agonisten untersucht und eine detaillierte Studie zu ihren Wirkmechanismen durchgeführt.

Diese Technologie ermöglicht die quantitative und gleichzeitige Überwachung von Kalziumveränderungen in mehreren Zellen in Echtzeit und ist damit ein einfacher und schneller Ansatz für Forschungsanwendungen. Unser Ziel ist es, den Behandlungsmechanismus der traditionellen chinesischen Medizin für die verschiedenen Krankheiten durch die Modernisierung von Kalzium-verwandten Ionenkanälen zu erforschen. Bereiten Sie zunächst sterile Objektträger mit einem Durchmesser von acht Millimetern vor und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte.

Geben Sie 500 Mikroliter Poly-D-Lycin-Puffer in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Beschichtung zu ermöglichen. Entsorgen Sie dann mit einer Pipette die Beschichtungslösung aus jeder Vertiefung.

Waschen Sie die Ditoletten einmal mit Dulbecco's PBS und legen Sie die gewaschenen Dias für den späteren Gebrauch beiseite. Säen Sie die Zellen auf die vorbereitete 24-Well-Platte mit einer Dichte von etwa 1,5 mal 10 hoch 5 Zellen pro Well und legen Sie die Platte in den Inkubator, bis die Zellen adhärent sind. Mischen Sie anschließend die Fura-2/AM-Stammlösung und Pluronic F-127 mit dem Hank-Puffer, der 1,3 millimolare Calciumionen enthält.

Decken Sie die Arbeitslösung Fura-2/AM mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Licht zu schützen. Zur Vorbehandlung der Zellen werden die Objektträger mit den Zellen auf eine neue 24-Well-Platte mit Hank-Puffer übertragen. Entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette aus jeder Vertiefung und geben Sie 500 Mikroliter Fura-2/AM-Arbeitspuffer in jede Vertiefung.

Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, damit die Sonde geladen werden kann. Entfernen Sie dann den Fura-2/AM-Arbeitspuffer aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen dreimal mit Hanks Puffer, um überschüssiges Fura-2/AM zu entfernen. Zu Beginn erhalten Sie die vorbehandelten Zellen für die Einzelzell-Calcium-Bildgebung und starten alle Komponenten des Fluoreszenzmikroskops.

Öffnen Sie die Fluoreszenzbildgebungssoftware aus den verfügbaren Optionen. Wählen Sie das gewünschte Protokoll aus und klicken Sie auf Okay. Wählen Sie dann im Hauptmenü die Option Neues Experiment, um einen neuen Versuchsaufbau zu starten.

Montieren Sie nun die Perfusionskammer auf dem Mikroskoptisch und platzieren Sie die mit Fura-2/AM behandelten Zellobjektträger vorsichtig in der Kammer mit der Hank-Pufferlösung. Passen Sie den Fokus bei weißem Licht für eine optimale Betrachtung an. Wählen Sie in der Systemsteuerung des Experiments die Option Fokus aus.

Wählen Sie die gewünschte Wellenlänge für die Fokussierung, z. B. 380 Nanometer, und klicken Sie auf Fokussierung starten, um die Fokuseinstellungen zu starten. Passen Sie den Fokus auf die Zellen mit der Option "Grobfokus" an, um das Objektiv näher zu bringen, gefolgt von "Fokus suchen" für präzise Anpassungen. Beobachten Sie die Expression des Zielproteins bei Wellenlängen von FITC oder TRITC.

Klicken Sie dann auf "Fokussierung stoppen" und schließen Sie das Fokusfenster. Klicken Sie in der Taskleiste auf Experiment konfigurieren und wählen Sie in den Konfigurationseinstellungen die gewünschten Geschosse für die Bildgebung aus. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Region in der Menüleiste, um Bereiche für die Bildgebung zu definieren, und wählen Sie den gewünschten Beleuchtungstyp für die Bildgebung aus.

Klicken Sie auf Bilder erfassen und drücken Sie dann OK, um Bilder aufzunehmen. Identifizieren Sie die gewünschten Zellen, die das Zielprotein unter Fluoreszenz exprimieren, unter Berücksichtigung des Blindwerts mit den Kontrollen unter 380 Nanometern. Um eine ausgewählte Region rückgängig zu machen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Kreis und wählen Sie Region löschen.

Öffnen Sie das Menü "Referenzen", aktivieren Sie das Kontrollkästchen für "Referenzen subtrahieren" und klicken Sie dann auf "OK", um die Hintergrundsubtraktion anzuwenden. Klicken Sie in der Systemsteuerung des Experiments auf Log Data, um die Experimentdaten aufzuzeichnen. Legen Sie im Abschnitt Zeitraffer der Systemsteuerung das Datenerfassungsintervall auf eine Sekunde fest.

Klicken Sie dann in der Systemsteuerung des Experiments auf Zero Clock and Acquire, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Wenden Sie nun Behandlungen gemäß den Anforderungen auf die Zellen an. Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Pause, um den Vorgang zu stoppen.

Speichern Sie die erfassten Daten und fahren Sie mit der Analyse fort. Um das Experiment zu beenden, klicken Sie auf Datei und wählen Sie Experiment schließen. Schließen Sie abschließend die Software und übertragen Sie alle gespeicherten Daten vom Computer.

Primäre Keratinozyten, die mit der Fura-2-Sonde beladen waren, zeigten eine sichtbare Zellmorphologie bei einer Wellenlänge von 380 Nanometern. Die thermische Reaktion der Keratinozyten zeigte einen Anstieg der intrazellulären Kalziumionenkonzentration während des Erhitzens, wobei eine ähnliche Reaktion während des Abkühlens beobachtet wurde. Die thermische Reaktion wurde in Keratinozyten aufgehoben, da das STIM1-Gen fehlte, was auf die Rolle des Gens bei der thermischen Kalziumsignalübertragung hinweist.

HEK293T Zellen, die STIM1/Orai1 überexprimierten, zeigten eine bemerkenswerte thermische Reaktion beim Abkühlen, was die erfolgreiche Genexpression bestätigte, wie grüne und rote Fluoreszenzmarker belegen. Die speicherbetriebene Calciumeintrittsreaktion in den Zellen über die Expression von STIM1-Orai1 wurde effektiv durch sequentielle Änderungen der extrazellulären Calciumkonzentration und der Cyclopiazonsäure-Edition durch Überfluss induziert. Das direkte Pipettieren von Capsaicin, einem TRPV1-Agonisten, löste einen extrazellulären Kalziumeinstrom in den Zellen aus, die das TRPV1-Plasmid exprimieren.