Aufzeichnung von nach innen gerichteten gleichgerichteten k⁺ Strömen in frisch isolierten glatten Muskelzellen der Arteria basilaris mittels Patch-Clamp-Technik

Meine Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf die kardiovaskuläre zerebrovaskuläre Elektrophysiologie. Diese Studie beschreibt eine Methode zur Isolierung primärer vaskulärer Muskelzellen und unter Verwendung der Ganzzell-Pinch-Clamp-Technologie, um ihre elektrophysiologischen Eigenschaften zu unterstützen. Die Isolierung frischer Zellen hat Einschränkungen, wie z. B. den Einfluss der Temperatur auf die Enzymtrennung, unterschiedliche Verdauungszeiten für verschiedene Blutgefäße und die sofortige Fähigkeit in der natürlichen Umgebung der Zellen.

Darüber hinaus stellt die Pinch-Clamp-Technologie Herausforderungen bei Decken- und Membranbrüchen dar, die eine fachkundige Bedienung erfordern. Dieses Protokoll erleichtert die Forschung in der einfachen Gewinnung aktiver Primärzellen aus manuellen Arterien und muss schnell die Anwendung der Pinch-Clamp-Technik einläuten. Füllen Sie zunächst eine Petrischale mit kalter physiologischer Kochsalzlösung, die mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gesättigt ist.

Lege ein isoliertes Rattengehirn in die Petrischale. Positionieren Sie das Gehirn ventral nach oben in der Petrischale und sichern Sie es mit Nadeln. Lokalisieren Sie unter einem Lichtmikroskop die Arteria basilaris.

Entfernen Sie mit Autoklav, Pinzette und Schere vorsichtig das umliegende Gewebe. Führen Sie anschließend einen zwei Zentimeter langen Draht mit einem Durchmesser von 25 Mikrometern in die isolierte Arteria basilaris ein. Reiben Sie die Innenwand der Arterie vorsichtig mit dem Draht ab, um das Gefäßendothel effektiv zu entfernen.

Um glatte Muskelzellen zu isolieren, erhitzen Sie zunächst die Lösungen in Reagenzgläsern eins bis drei. Übertragen Sie die isolierte Arteria basilaris in das zweite Reagenzglas. Inkubieren Sie das Gemisch 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, während Sie kontinuierlich ein Gemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid in das Röhrchen injizieren.

Übertragen Sie als Nächstes die Arteria basilaris aus dem zweiten Reagenzglas in das dritte Reagenzglas und inkubieren Sie. Übertragen Sie einen Milliliter vorgewärmte Zelltrennlösung aus dem ersten Reagenzglas in das dritte Reagenzglas. Setzen Sie die Injektion von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid fort, während die enzymatische Behandlung drei Minuten lang aufrechterhalten wird.

Triturieren Sie das Präparat der Arteria basilaris, um Zellen freizusetzen. Pipettieren Sie anschließend vier Milliliter kalte Trennlösung in das Reagenzglas drei, um den enzymatischen Prozess zu beenden. Die Mischung bei 59 g sechs Minuten lang zentrifugieren.

Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Dann erneut die Kalttrennlösung zugeben. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Überstand.

Lassen Sie einen Milliliter der Zellsuspension übrig. Lagern Sie die Zellsuspension sechs bis acht Stunden bei vier Grad Celsius. 100 Mikroliter der Zellsuspension in ein Bad überführen.

Geben Sie einen Milliliter extrazelluläre Flüssigkeit in das Bad und lassen Sie es ruhen. Schalten Sie zunächst eine polare Mikropipette ein. Platzieren Sie ein Glasröhrchen in der Polposition.

Wählen Sie auf dem Bedienfeld Programm eins aus. Klicken Sie auf Enter und greifen Sie auf Programm eins zu. Führen Sie nun einen Rampentest durch, indem Sie auf dem Bedienfeld auf Rampe klicken, um den Heizwert des Glasrohrs zu messen.

Setzen Sie ein neues Glasrohr ein. Wählen Sie dann Programm eins aus und klicken Sie auf die Eingabetaste, um die Mikropipette herzustellen. Um den Pflegestrom zu erfassen, starten Sie zunächst die Datenerfassungssoftware.

Wählen Sie die Datei aus und klicken Sie dann auf Datendateinamen festlegen, um einen Datenspeicherpfad einzurichten. Aktivieren Sie die Funktion Membrantest im Werkzeugmenü. Platzieren Sie eine Probe isolierter glatter Muskelzellen aus der Basilararterie einer Ratte in der Mitte des Kamerabildes eines Mikroskops.

Tauchen Sie die Referenzdrahtspitze in die Badlösung. Füllen Sie dann 20% der hergestellten Mikropipette mit der intrazellulären Lösung. Befestigen Sie die geladene Mikropipette auf dem Aufnahmeelektrodenhalter.

Üben Sie nun mit einer Spritze Überdruck aus. Schieben Sie die Pipettenspitze in die Badlösung und stellen Sie den Pipettenversatz an der Signalverstärkersoftware so ein, dass die aktuelle Basislinie auf null Pikoampere eingestellt wird. Drücken Sie die Pipette vorsichtig gegen die Zellmembran.

Beobachten Sie eine Erhöhung der Dichtungsbeständigkeit gegen mindestens ein Magom. Überdruck aufheben und Unterdruck ausüben. Um einen hohen Widerstand mit einem Dichtungswiderstand von mindestens einem Giggom zu erreichen, stellen Sie die Haltespannung auf minus 60 Millivolt ein und kompensieren Sie die Elektrodenkapazität mit CP FAST und CP slow.

Üben Sie einen kurzen Unterdruck aus, um die Zellmembran zu durchbrechen und eine ganze Zellkonfiguration zu bilden. Wählen Sie in der Signalverstärker-Software die Option "Ganze Zelle" aus. Klicken Sie dann auf Auto, um die Membrankapazitätskompensation zu aktivieren.

Laden Sie das kir-Protokoll und starten Sie die Datenaufzeichnung. Frisch isolierte glatte Muskelzellen mit Spindelmorphologie wurden isoliert. Die Zellen waren gesund und für Patch-Clamp-Experimente geeignet.

Ein typischer Härtungsstrom zeigte eine nach innen gerichtete Gleichrichtung bei negativen Spannungen mit minimalem oder keinem Kaliumionenstromfluss bei positiven Spannungen. Bariumchlorid in Konzentrationen von 100 bis 300 Mikromol pro Liter hemmte effektiv die Kir-Kanal-Aktivität, was den Strom als Kir bestätigte. Natriumnitroprussid erhöhte den Kir-Strom, was auf die Rolle von Kir-Kanälen bei der SNP-induzierten Vasodilatation hinweist.

Der Vergleich der Stromspannungsverhältnisse zeigte eine Abnahme der Stromdichte in Gegenwart von Bariumchlorid und eine Zunahme mit SNP.