Massenzytometrische Analyse systemischer und lokaler Immunantworten beim hepatozellulären Karzinom

Die Massenzytometrie ermöglicht es uns, sowohl systematische als auch lokale Immunantworten beim hepatozellulären Karzinom zu analysieren. Durch die Profilierung von Immunzellen auf Einzelzellebene identifizieren wir einzigartige Untergruppen und die funktionellen Zustände, die mit der Tumorprogression verbunden sind, und bieten Einblicke in die Mechanismen der Immunevasion und die potenziellen therapeutischen Ziele für personalisierte Behandlungen. Unser Protokoll verwendet Massenzytometrie, um über 14 Marker gleichzeitig auf Einzelzellebene zu analysieren, wodurch spektrale Überlappungen vermieden werden, wie sie bei der herkömmlichen Durchflusszytometrie auftreten. Dies beinhaltet die präzise Identifizierung realer Zellpopulationen und liefert hochdimensionale Daten für ein detailliertes Immunprofiling und die Entdeckung von Biomarkern.

[Erzähler] Zu Beginn tauen Sie die einkernige Zelle des gefrorenen peripheren Blutes und die Suspensionen der Hepatokarzinomzellen auf. Nach der Zellregeneration resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS ohne Kalzium und Magnesium. Cisplatin bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Mikromolaren zugeben, gut mischen und zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Um die Reaktion zu stoppen, zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 500 g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie dann einen Milliliter Zellfärbepuffer in jedes Röhrchen. Nach dem erneuten Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig entsorgt. Um eine FC-Rezeptorblockierung durchzuführen, bereiten Sie zunächst eine 50-Mikroliter-Blockmischung für jede Probe vor und kombinieren Sie 48 Mikroliter Zellfärbepuffer mit zwei Mikrolitern FC-Blockierungslösung. Das Zellpellet im Block resuspendieren, mischen und inkubieren. Geben Sie anschließend 1,1 Mikroliter jedes Antikörpers pro Probe in ein markiertes Röhrchen, um die Membranprotein-Antikörpermischung vorzubereiten. Füllen Sie das Volumen mit Zellfärbepuffer auf 55 Mikroliter auf. Übertragen Sie 50 Mikroliter der vorbereiteten Antikörpermischung in jedes Probenröhrchen, wodurch das Gesamtvolumen auf 100 Mikroliter erhöht wird. Schwenken Sie dann die Proben vorsichtig, um sie zu mischen, bevor Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie einen Milliliter Zellfärbepuffer in jedes Probenröhrchen. Bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Nach der letzten Wäsche die restliche Flüssigkeit kurz mit dem Zellpellet verwirbeln, um die Zellen gründlich wieder zu resuspendieren. Für die Zellkernproteinfärbung geben Sie 500 Mikroliter der gemischten Fixierlösung zu den resuspendierten Zellen. Mischen Sie die Proben vorsichtig, bevor Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Pipettieren Sie anschließend 1000 Mikroliter Permeabilisierungspuffer in jedes Röhrchen, um die Zellen zu waschen. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie 50 Mikroliter des Antikörpergemisches in jedes Röhrchen, nachdem Sie den Überstand verworfen haben. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig, um sie vor der Inkubation gründlich zu mischen. Pipettieren Sie anschließend 1000 Mikroliter Permeabilisierungspuffer in jedes Röhrchen, zentrifugieren Sie erneut und verwerfen Sie dann den Überstand. Um die Zellen zu fixieren, geben Sie einen Milliliter 1,6 % Formaldehyd, das in PBS hergestellt wurde, in jedes Probenröhrchen und wirbeln Sie es ein, um den Inhalt gründlich zu mischen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Proben zentrifugiert und der Überstand verworfen. Für die nukleare Interkalationsfärbung verdünnen Sie zuerst den Cell-ID Intercalator Iridium mit Fix- und Permeabilisierungspuffer. Pipettieren Sie einen Milliliter der Interkalationslösung in jede Probe. Vorsichtig mischen und vortexen. Legen Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie dann wie zuvor. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, pipettieren Sie 1000 Mikroliter Zellfärbepuffer in das Röhrchen. Die Röhrchen werden fünf Minuten lang bei 800 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen in 450 bis 900 Mikrolitern deionisiertem Wasser. Färben Sie die Zellen mit Trypanblau für die Zellzählung vor der weiteren Analyse. Schalten Sie zunächst das Massenzytometer ein und starten Sie das Programm. Analysieren Sie die Proben im CyTOF-System und erfassen Sie die massenzytometrischen Daten der mononukleären Zellen des peripheren Blutes und der Hepatokarzinom-Zellproben. Starten Sie die Datenverarbeitungssoftware auf dem Gerät und verarbeiten Sie die CD45+-Zellpopulation in der FCS-Datei vor. Beseitigen Sie dann abgestorbene Zellen durch Viabilitätsfärbung, wie z. B. Cisplatin-Ausschluss. Gatet die CD45+-Population, um sich auf Immunzellen zu konzentrieren, und exportiert die Gated Population zur weiteren Analyse. Transformieren Sie die Daten mit einem Co-Faktor von fünf. Starten Sie als Nächstes die Clustering-Software und identifizieren Sie die Hauptcluster basierend auf dem SPADE-Algorithmus, indem Sie Zellen mit ähnlichen Markerexpressionsprofilen in Clustern gruppieren. Wenden Sie hierarchische stochastische Nachbareinbettung (HSNE) an, um die Dimensionalität zu reduzieren und unterschiedliche Cluster zu identifizieren. Verwenden Sie dann das CyTOF-Kit-Paket in unserer Software, um ein Re-Clustering der Hauptcluster durchzuführen. Verwenden Sie das Programm PhenoGraph, um Subcluster mit Standardparametern zu identifizieren. Insgesamt wurden 14 verschiedene Zelltypen in den mononukleären Zellproben des peripheren Blutes identifiziert. Die Markerexpressionsmuster für jeden der 14 Zelltypen wurden in der Heatmap detailliert beschrieben und zeigen einzigartige Expressionsprofile für unterschiedliche Zellpopulationen. Die Verteilung dieser Zelltypen variierte zwischen den Proben, wobei Probe D einen höheren Anteil an CD4-T-Zellen aufwies, Probe A und B eine signifikante Anreicherung von B-Zellen aufwiesen und CD141+, konventionelle dendritische Zellen, überwiegend in Probe C vorhanden waren. In den Gewebeproben wurden acht Zelltypen identifiziert, darunter Monozyten, T-Zellen, Neutrophile, natürliche Killerzellen, B-Zellen, plasmazytoide dendritische Zellen, Eosinophile und myeloische dendritische Zellen. Markerexpressionsprofile für die Gewebezelltypen zeigen unterschiedliche Muster für jede Zellpopulation. Die Gewebeproben zeigten einen konsistenten Anteil an Zelltypen bei allen Patienten, was die gemeinsamen immunologischen Merkmale des hepatozellulären Karzinoms widerspiegelt.