3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung

Ziel dieser Forschung ist es, die Morphologie und räumliche Verteilung von Parasiten im retinalen Gefäßsystem mit Hilfe fortschrittlicher bildgebender Verfahren zu untersuchen. Um einen detaillierten Überblick über die morphologischen Eigenschaften von Parasiten zu erhalten, wurde in der Studie ein neuer Ansatz beschrieben, der die retroorbitale Injektion von Fluoreszenzmitteln, Immunfluoreszenzfärbung und Gewebereinigungsbehandlung kombiniert, um die Forschung auf unserem Gebiet voranzutreiben.

Im Vergleich zum Vor-Clearing-Zustand des retinalen Gewebes der Maus sind die Hintergrundsignale von Blutgefäßen und Parasiten, die mit fluoreszierendem Tomatenlactin und PDGFR-beta markiert sind, nach der Gewebereinigung signifikant reduziert, was eine genauere Beobachtung ihrer räumlichen Beziehung ermöglicht.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Techniken sehr gut geeignet sind, um die Parasiten im retinalen Gefäßsystem in der gesamten Mount-Netzhaut nachzuweisen. Die Kombination dieser histologischen Techniken ist ein effektiver Ansatz, um die morphologischen Eigenschaften von Parasiten detailliert aus einer dreidimensionalen Ansicht zu visualisieren.

[Dozent] Platzieren Sie die betäubte Maus zunächst mit dem Kopf nach links in der rechten Seitenlage. Drücken Sie vorsichtig mit zwei Fingern auf den periorbitalen Bereich, um das linke Auge der Maus freizulegen. Stechen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, vorsichtig etwa zwei bis drei Millimeter in den Orbitalvenensinus ein, wobei Sie darauf achten, dass die Abschrägung der Nadel in einem 45-Grad-Winkel nach vorne zeigt. Injizieren Sie 0,1 Milliliter fluoreszierendes Tomatenlactin in die Orbitalvenenhöhle. Nach fünf Minuten retroorbitaler Injektion euthanasieren Sie die Maus und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Brusthöhle zu öffnen. Führen Sie eine 24-Gauge-Nadel zwei Millimeter durch die linksventrikuläre Spitze in den linken Herzventrikel ein. Führen Sie eine Perfusion mit einer Rate von drei Millilitern pro Minute mit 20 Millilitern 0,9 % physiologischer Kochsalzlösung durch, gefolgt von 20 Millilitern physiologischer Kochsalzlösung mit 4 % Kochsalzlösung. Injizieren Sie 0,1 Milliliter 0,9 % Formaldehyd in 0,1 molaren Phosphatpuffer. Legen Sie dann die geopferte Maus auf die Seite und entfernen Sie mit einer Schere die Haut, die die Augen bedeckt. Entkernen Sie die Augen mit Schere und Pinzette. Schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe ab und heben Sie das Auge heraus. Übertragen Sie das Auge auf eine 12-Well-Platte, um es zwei Stunden lang in 4 % Formaldehyd in 0,1 molaren Phosphatpuffer zu fixieren. Nach der Fixierung kryokontieren Sie das Auge in 25% Saccharose in 0,1 molaren Phosphatpuffer bei vier Grad Celsius, bis es auf den Boden der Lösung sinkt. Übertragen Sie das Auge mit einer Pastor-Pipette aus Kunststoff in eine Petrischale mit 0,1 molaren Phosphatpuffer. Durchstechen Sie den Rand der Hornhaut mit einer scharfen Schere, schneiden Sie um die Hornhaut und die Iris herum und entsorgen Sie sie. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Linse und den Glaskörper. Ziehe dann mit einer feinen Pinzette die becherförmige Netzhaut von der Mitte des Auges weg. Spülen Sie die Netzhaut mit 0,1 molaren Phosphatpuffer in einer sauberen Petrischale. Nachdem Sie die becherförmige Mausnetzhaut isoliert haben, inkubieren Sie sie in einem 20-Stunden-Inkubator mit einer 2%igen Triton X-100-Lösung in 0,1 molaren Phosphatpuffer über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag übertragen Sie die Netzhaut in die Blockierungslösung und drehen sich über Nacht bei vier Grad Celsius mit 72 U/min auf dem Shaker. Legen Sie dann die Netzhaut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das die primären Antikörper von Ziegen-Anti-PDGFR beta in Verdünnungspuffer enthält. Drehen Sie das Rohr auf dem Shaker zwei Tage lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Netzhaut nach zwei Tagen zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur. Legen Sie die Netzhaut in den Waschpuffer und geben Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in den Shaker. Am nächsten Tag wird die Netzhaut in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, das eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter Sekundärantikörper des Esel-Anti-Ziegen-Antikörpers 488 und 0,2 Nanogramm pro Milliliter fluoreszierender Kernfärbung DAPI enthält. Drehen Sie das Rohr am Shaker fünf Stunden lang bei 72 U/min bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Netzhaut in einer Sechs-Well-Platte mit Waschpuffer zweimal eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Netzhaut in Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie am nächsten Tag die Netzhaut in das Gewebereinigungsreagenz und drehen Sie es eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius sanft auf dem Shaker bei 60 U/min. Spülen Sie die Netzhaut nach der Gewebereinigung mit 0,1 molaren Phosphatpuffer in einer sauberen Petrischale. Machen Sie mit einer Federschere vier radiale Schnitte, die etwa 2/3 des Radius der Netzhaut erreichen, um eine Blütenblattform zu erhalten. Glätten Sie die Netzhaut und montieren Sie sie mit der Innenseite der Netzhaut nach oben auf einen Objektträger. Verwenden Sie ein kleines Stück saugfähiges Papier, um überschüssigen Phosphatpuffer zu entfernen. Umkreisen Sie die montierte Netzhaut mit einem Abstandshalter. Füllen Sie die Lücke mit frischem Gewebereinigungsreagenz und legen Sie einen Deckglas darauf. Scannen Sie die Montageansichten der markierten Netzhaut mit dem Panorama-Gewebeschnittscanner. Nehmen Sie Bilder mit höherer Vergrößerung mit einem Bildgebungssystem auf, das mit einem 2-fachen und einem 10-fachen Objektiv mit numerischen Aperturen von 0,40 bzw. 0,95 ausgestattet ist. Nehmen Sie 50Z-Stack-Bilder von der beschrifteten Netzhaut in zwei Mikrometerrahmen auf. Klicken Sie nacheinander auf Start-Fokusebene festlegen, End-Fokusebene festlegen, Schrittweite festlegen, wählen Sie Tiefenmuster, Bildaufnahme und Z-Serie, um alle Bilder im Projektions- und Topografiemodus in ein einzelnes fokussiertes Bild zu integrieren. Nehmen Sie als Nächstes Bilder mit der grünen Fluoreszenz bei 499 und 519 Nanometern, der roten Fluoreszenz bei 591 und 618 Nanometern und der blauen Fluoreszenz bei 401 und 421 Nanometern auf. Wählen Sie nacheinander Neue Oberflächen hinzufügen, wählen Sie Volumeneinstellungen, wählen Sie Quellkanal, passen Sie die Anzeige an, passen Sie den Oberflächenwinkel an und machen Sie einen Schnappschuss, um die konfokalen Z-Stack-Bilder in die Analysesoftware zu importieren und die Bilder im dreidimensionalen Muster zu rekonstruieren. Die Gewebetransparenz der gesamten Mount-Netzhaut war nach der Gewebereinigungsbehandlung im Vergleich zur Netzhaut ohne Gewebereinigung erhöht. Mit Tomatenlektin markierte retinale Gefäße und mit PDGFR-β markierte Netzhautparasiten waren sowohl vor als auch nach der Gewebereinigung sichtbar, aber das Hintergrundrauschen war nach der Gewebereinigung reduziert. Entlang des Gefäßbaums wurden retinale Parasiten beobachtet, die eine abgestufte Verteilung von den zentralen zu den peripheren Regionen der Netzhaut zeigten. Die dreidimensionalen Z-Stack-Bilder der gereinigten Netzhaut zeigten Parasiten, die eng um retinale Gefäße mit unterschiedlichen Durchmessern gewickelt waren, mit stärkerer PDGFR-β-Färbung in den Kapillaren.