Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Meine Forschungstätigkeit konzentriert sich auf das Verständnis der Mechanismen, die Makrophagen resistent gegen eine Infektion mit HIV machen, dem Virus, das für die AIDS-Pandemie verantwortlich ist. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Aktivität von Enzymen, die als HT-1 bezeichnet werden und die NTPs, die Bausteine des viralen Genoms, abbauen. Aber dieses Enzym hat auch andere Aktivitäten, die wir aufzuklären versuchen.

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um THP1-Zellen gentechnisch zu verändern. Diese Zellen sind ein gut etablierter Ersatz für menschliche Makrophagen zur Untersuchung. Zum Beispiel die Replikation von HIV-1.

Diese Zellen sind schwer zu transfizieren, um ihren Proteingehalt zu manipulieren. Daher etablieren wir Methoden, um ihr Genom mit Hilfe der CRISPR-Cas9-Technologie zu manipulieren. Vom Design von SG-RNAs bis hin zur Validierung polyklonaler und monoklonaler Populationen.

Unser Protokoll zielt darauf ab, eine hocheffiziente Editierung eines Gens von Interesse in THP1-Zellen zu erreichen, das mit vorassemblierten Ribonukleoproteinkomplexen elektroporiert wird, die von den Cas9-Nuklease-Energie-RNAs hergestellt werden. Bei diesem Ansatz ist die Cas9-Aktivität zeitlich begrenzt. Dies reduziert die Möglichkeit, Zieleffekte zu generieren, die häufig beim Einsatz von Lenti-Vektoren auftreten.

Und in diesem Fall verlängert die Cas9-Expression tatsächlich die Zeit und kann daher für die Zelle schädlich sein. Füllen Sie zunächst jede Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte mit 500 Mikrolitern RPMI 1640 Medium ohne Antibiotikum und ergänzt mit 20% hitzeinaktiviertem und gefiltertem FBS. Stellen Sie die Platte über Nacht in einen befeuchteten Inkubator.

Um die trockenen Single Guide oder sgRNAs auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolaren zu rehydrieren, fügen Sie 10 Mikroliter TE-Puffer pro einem Nanomol sgRNA hinzu. Die Lösung 30 Sekunden lang vortexen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, um eine vollständige Rehydrierung zu gewährleisten. Am nächsten Tag zur Herstellung der 30 mikromolaren sgRNA-Arbeitslösung zunächst die 100 mikromolare sgRNA-Stammlösung mit einer Pipette kurz homogenisieren und dann den Stiel in nukleasefreiem Wasser verdünnen.

Die Lösung 30 Sekunden lang vorläufig und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verdünnen Sie jeweils einen Mikroliter der 30 mikromolaren sgRNA-Arbeitslösungen und 0,5 Mikroliter 20 mikromolare Cas9-Lösung in 3,5 Mikroliter Resuspensionspuffer R, um die Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteine zusammenzusetzen, und fügen Sie ein Verhältnis von eins zu neun molaren hinzu. Kurz vortexen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Zur Herstellung einer unbearbeiteten Kontrolle werden 0,5 Mikroliter 20 mikromolare Cas9-Lösung auf 6,5 Mikroliter Resuspensionspuffer R.Vortex gegeben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, fünf Mikroliter Resuspensionspuffer R zu den Proben gegeben, um ein Endvolumen von 12 Mikrolitern pro Elektroporationsbedingung zu erreichen. Um THP-1-Zellen nach der Zellzählung vorzubereiten, entnehmen Sie ein Volumen, das 0,2 mal 10 hoch sechs THP-1-Zellen entspricht, und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 20 Grad Celsius bei 336 G, aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern PBS. Zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie das Zellpellet in den 12 Mikrolitern Ribonukleoproteinlösung.

Um das Elektroporationssystem einzurichten, stellen Sie die Pipettierstation unter eine Biosicherheitswerkbank und positionieren Sie einen Elektroporationsschlauch im Schrank, geben Sie drei Milliliter Puffer E aus dem Elektroporationskit in den Elektroporationsschlauch. Schalten Sie das Elektroporationsgerät ein und stellen Sie über den Touchscreen die Elektroporationsparameter und die Spannung auf 1.500 Volt ein. Dauer bis 10 Millisekunden.

Und Nummer bis drei. Rüsten Sie die Elektroporationspipette mit einer Spitze aus und aspirieren Sie 10 Mikroliter der Ribonukleoprotein-THP-1-Lösung. Führen Sie die Pipette in den Elektroporationsschlauch ein und drücken Sie auf dem Bildschirm des Elektroporationsgeräts auf Start.

Warten Sie, bis die Meldung abgeschlossen angezeigt wird, und entfernen Sie die Pipette aus dem Röhrchen. Übertragen Sie die THP-1-Zellen in eine Vertiefung der vorgeheizten 24-Well-Kulturplatte und homogenisieren Sie die Probe vorsichtig. Setzen Sie die Platte wieder in den befeuchteten Inkubator ein und lassen Sie die Zellen 72 Stunden lang ungestört ruhen.

Nach der Elektroporation und Zellzählung wird ein Volumen, das der Stärke von 0,1 mal 10 entspricht, in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen entnommen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 336 G bei 20 Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 500 Mikrolitern PBS resuspendieren. Auch hier werden die Zellen zentrifugiert, so viel Überstand wie möglich angesaugt, ohne das Pellet zu stören, und das Pellet einrasten, einfrieren.

Für die Extraktion von genomischer DNA resuspendieren Sie das Pellet mit 50 Mikrolitern DNA-Extraktionslösung. Homogenisieren Sie es und übertragen Sie das gesamte Volumen in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Wirbeln Sie das Röhrchen vor und zentrifugieren Sie es kurz für einen Impuls von drei Sekunden.

Legen Sie das Rohr in einen Thermocycler und erhitzen Sie es 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius, gefolgt von 98 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend die extrahierte DNA mit 90 Mikrolitern Reinstwasser verdünnen, vortexen und drei Sekunden lang kurz bei 5000 g zentrifugieren. Verdünnen Sie den PCR-Primer in Reinstwasser auf eine Endkonzentration von 10 Mikromol.

Bereiten Sie den PCR-Mix in einem 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen vor. Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das Programm mit den angegebenen Einstellungen aus. Für polyklonal editierte Populationen in einem neuen 0,2-Milliliter-Röhrchen.

Mischen Sie 17,5 Mikroliter des PCR-Amplikons mit zwei Mikrolitern E-Puffer zwei, um ein Endvolumen von 19,5 Mikrolitern zu erhalten. Wirbeln Sie die Lösung vor und zentrifugieren Sie kurz, alternativ mischen Sie zum Screening von Einzelzellklone die PCR-Produkte aus den editierten und uneditierten Kontrollzellen in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis. Für die Hetero-Duplex-Bildung legen Sie die Rohre in einen Thermocycler und führen das angegebene Programm aus.

Nach der Hetero-Duplex-Bildung werden 0,5 Mikroliter T-7-Endonuklease, eine Lösung, in das Röhrchen gegeben und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Um die Proben für die Gelelektrophorese vorzubereiten, mischen Sie fünf Mikroliter des T7-Endonuklease-1-Verdauungsprodukts oder des unverdauten PCR-Produkts mit fünf Mikrolitern Wasser und zwei Mikrolitern sechs xDNA-Beladungsfarbstoffen, laden Sie die Proben und die Größenleiter in das Gel und lassen Sie das Gel 45 Minuten lang bei 80 Volt laufen. Die CRISPR-Cas9-vermittelte Geneditierung des EGFP-Locus führte zu einem starken Rückgang der GFP-positiven Zellen und erreichte am siebten Tag nach der Elektroporation eine Reduktion von mehr als 90 %.

Am dritten Tag nach der Elektroporation hatte sich die Zellzahl aufgrund von Elektroporations-induziertem Stress halbiert, erholte sich aber bis zum siebten Tag vollständig im vollständigen RPMI-Medium. T7-Endonuklease und die Gelelektrophorese von Agarose zeigten den Verlust von etwa 75 Basenpaarfragmenten in editierten Zellen, was die CRISPR-Editierung der EGFP-Zielstelle bestätigt.