Name: Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung intrazellulärer Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung von Glykokonjugaten ohne spezialisierte Superauflösungsmikroskope.

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<meta charset="utf8"></head><body>Expansionsmikroskopie zur Visualisierung intrazellulärer sialylierter Glykane mittels MOE

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</ol>

Das derzeitige CuAAC-Markierungsprotokoll enthält kein Aminoguanidin im Reaktionspuffer. Da es darauf abzielt, intrazelluläre Glykokonjugate zu visualisieren, wird es an Zellen durchgeführt, die nach dem metabolischen Einbauschritt fixiert sind, um Probleme mit der Zytotoxizität zu vermeiden und die Aufnahme des katalytischen Systems zu verbessern. Die Verwendung von Aminoguanidin wird typischerweise für die Markierung der Zelloberfläche lebender Zellen empfohlen, um Nebenreaktionen zwischen Dehydroascorbat und Arginin-,...

Die Fluoreszenzmikroskopie wird zwar häufig zur Markierung und Visualisierung spezifischer Moleküle in Zellen verwendet, ist aber von Natur aus in ihrer Auflösung durch Abbes Beugungsgrenze des Lichts1 begrenzt, die die Fähigkeit einschränkt, zwischen Objekten zu unterscheiden, die näher als etwa 200-250 nm sind. Diese Einschränkung ergibt sich aus der Wellennatur des Lichts und der numerischen Apertur der Objektivlinse des Mikroskops, was eine Herausforderung bei der Abbildung subzellulärer Strukturen darstellt. Die Überwindung dieser Einschränkungen ermöglicht bessere Einblicke in bestimmte biologische Prozesse auf nanometrischer Skala.
Um die Beugungsgrenze des Lichts zu überwinden, wurden hochauflösende Mikroskopietechniken wie STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) und STED (Stimulated Emission Depletion) entwickelt 2,3. STORM beruht auf der stochastischen Aktivierung von Fluorophoren, so dass zu jedem Zeitpunkt nur eine dünn besetzte Teilmenge abgebildet werden kann. Dies ermöglicht die präzise Lokalisierung einzelner Fluorophore, was die Rekonstruktion eines hochauflösenden Bildes ermöglicht. STED hingegen verbessert die Auflösung, indem ein Verarmungslaser verwendet wird, um die Fluoreszenz um die Peripherie des Anregungsflecks selektiv zu löschen, wodurch die Punktspreizungsfunktion effektiv verengt wird.
Diese Ansätze stehen im Gegensatz zur Weitfeld- oder Konfokalmikroskopie, bei der alle Fluorophore gleichzeitig detektiert werden, was zu einem Bild führt, das alle Beugungsmuster kombiniert und die Unterscheidung zwischen einzelnen Fluorophoren in der Nähe verhindert, was zu einem Auflösungsverlust führt. Diese superauflösenden Methoden erfordern jedoch sehr spezifische Lichtquellen, Geräte, Probenvorbereitung und/oder Fluorophore, was diese Technologien kostspielig, in den meisten Labors schwer zugänglich und in Routineexperimenten schwierig zu implementieren macht. Diese Einschränkungen haben die wissenschaftliche Gemeinschaft dazu veranlasst, nach alternativen Lösungen zu suchen, um eine höhere Auflösung zu erreichen, die mit leicht verfügbaren Mikroskopiegeräten und routinemäßigen Färbeprotokollen kompatibel sind. Im Jahr 2015 entwickelten Boyden und seine Kollegen eine Methode, um die Einschränkungen der optischen Mikroskopie zu umgehen, indem die Probe physikalisch erweitert wird, die als Expansion Microscopy (ExM)4 bezeichnet wird.
ExM ist eine dreistufige Methode, die nanoskalige Details biologischer Proben liefert, ohne die Beugungsgrenze des Lichts zu überschreiten (Abbildung 1). Stattdessen werden herkömmliche beugungsbegrenzte Mikroskope verwendet, um Proben abzubilden, die physikalisch isotrop vergrößert wurden. Der erste Schritt, Gelierung genannt, besteht darin, die biologische Probe, typischerweise fixierte Zellen oder Gewebe, in ein quellfähiges Polyelektrolyt-Hydrogel auf Basis von Natriumacrylat und Acrylamid einzubetten. Die biologische Probe wird dann enzymatisch behandelt, um bestimmte Bestandteile wie Proteine oder Membranen teilweise abzubauen und dichte Zellstrukturen aufzubrechen, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig ausdehnen können. Dieser Schritt, der als Aufschluss bezeichnet wird, trägt dazu bei, indem die Strukturkomponenten der Probe in Bezug auf die mechanischen Eigenschaften homogenisiert werden, wodurch eine unterschiedliche Ausdehnung verhindert wird, die zu einer Verformung der Probe führen könnte. Im letzten Schritt, der sogenannten Expansion, wird die in das Hydrogel eingebettete und verdaute Probe in deionisiertes Wasser gelegt, wodurch sie aufquillt. Diese Technologie führt dazu, dass sich die Probe in jeder Dimension um einen linearen Vergrößerungsfaktor von etwa 4-5x ausdehnt, was die Visualisierung feiner zellulärer Details mit Standard-Mikroskopietechniken ermöglicht. Aufgrund der isotropen Natur der Expansion behält die innerhalb der Gelmatrix vergrößerte biologische Probe ihre dreidimensionalen geometrischen Details und die räumlichen Beziehungen zwischen ihren verschiedenen Strukturkomponenten bei. Räumliche Informationen bleiben also beim Aufquellen erhalten, während der Abstand zwischen den gelverankerten Fluoreszenzmarkierungen oder Biomolekülen gleichmäßig in alle Richtungen zunimmt. Dies ermöglicht eine bessere Trennung der Signale, was zu einer höheren Auflösung führt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Überblick über das ExM-Protokoll. (a) Gelierung: Die biologische Probe wird in einem quellfähigen Polyelektrolyt-Hydrogel verankert und eingebettet. (b) Aufschluss: Die mechanischen Eigenschaften der Probe werden durch den Einsatz von Enzymen und Detergenzien homogenisiert, wodurch Proteine und Lipidmembranen abgebaut werden, die sonst die Ausdehnung einschränken und Verzerrungen verursachen würden. (c) Expansion: Das Hydrogel wird in deionisiertes Wasser getaucht, wodurch es sich isotrop ausdehnt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Seit 2015 hat ExM erhebliche technologische Verbesserungen bei der Bewahrung von räumlichen Informationen erfahren. Insbesondere wurden verschiedene molekulare Anker entwickelt, um Biomoleküle kovalent direkt an das quellfähige Hydrogel 5,6 zu binden. In diesem Protokoll haben wir N-Acryloxysuccinimid (NAS) verwendet, das mit den freien Amingruppen von Biomolekülen (typischerweise Lysinreste oder N-terminale Positionen von Proteinen) reagiert, um eine Acryloylgruppe an die Proteine der Zelle, einschließlich Glykoproteine, zu biokonjugieren. Diese Acryloylgruppe reagiert dann während der Gelierung durch Vernetzungsreaktionen mit anderen Monomeren und verankert diese Biomoleküle direkt am Polymer.
ExM ist mit einer Vielzahl von Markierungsmethoden kompatibel, einschließlich des Metabolic Oligosaccharide Engineering (MOE). MOE ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Markierung von Glykanen ermöglicht, indem Analoga von Stoffwechselvorläufern einbezogen werden, die mit einem bioorthogonalen chemischen Griffausgestattet sind 7. Diese Analoga, die als chemische Reporter bekannt sind, integrieren sich in Stoffwechselwege, ohne Toxizität zu verursachen. Beim MOE-Ansatz werden Reportermonosaccharide metabolisch zu aktivierten Nukleotidzuckern verarbeitet und dann auf naszierende Glykokonjugate übertragen. Unser Hauptaugenmerk liegt auf der Erforschung der Sialylierung, insbesondere der intrazellulären Dynamik und des Transports von sialylierten N-Glykoproteinen, die aufgrund ihrer Rolle bei Zell-Zell-Interaktionen, Immunregulation und Entwicklung im Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit von entscheidender Bedeutung ist. Die abnormale Sialylierung wird mit Krankheiten wie Krebs 8,9,10,11, Infektionskrankheiten 12 und genetischen Störungen 13,14,15 in Verbindung gebracht, was sie zu einem wichtigen Ziel für die therapeutische Entwicklung und die Entdeckung von Biomarkern macht. Das Verständnis der Sialylierung verbessert die Einblicke in die Glykobiologie und Krankheitsmechanismen.
Die Sialylierung kann unter Verwendung von MOE mit Analoga der N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac), der am häufigsten vorkommenden Sialinsäure beim Menschen, oder mit Analoga von N-Acetylmannosamin (ManNAc), einem metabolischen Vorläufer von Neu5Ac, untersucht werden, der einen bioorthogonalen Griff trägt 8,16. ManNAc wird im Zytosol in Neu5Ac umgewandelt und dann im Zellkern zu Cytidin-5′-monophospho-N-neuraminsäure (CMP-Neu5Ac) aktiviert. Nach der Aktivierung zu einem Nukleotidzucker übertragen Sialyltransferasen im Golgi-Apparat Neu5Ac-Einheiten an die Endpositionen wachsender Glykanketten (Abbildung 2). Nach dem metabolischen Einbau von unnatürlichen ManNAc-Derivaten können die markierten sialylierten Glykane durch bioorthogonale Click-Chemie kovalent an ein Fluorophor gebunden werden, das eine reaktive Gruppe komplementär zum Reportergriff trägt. Dies ermöglicht die direkte Beobachtung von Glykokonjugaten in vivo oder ex vivo.
Für die meisten Monosaccharid-Reporter ist eine peracetylierte Form erforderlich, um die Plasmamembran durch passive Diffusion zu durchqueren. Es wurde jedoch gezeigt, dass sowohl peracetylierte als auch ungeschützte Reporter die Sialylierung effizient untersuchenkönnen 16. Ungeschützte Sialylierungsreporter sind in der Lage, durch aktive Transportmechanismen in Zellen einzudringen, nämlich Pinozytose für Neu5Ac-Analoga und ein noch nicht identifizierter Transporter für ManNAc. Während ungeschützte Zucker eine höhere Konzentration (typischerweise 100-500 μM) benötigen, um vergleichbare Wirkungen zu erzielen, können sie, sobald sie sich in der Zelle befinden, direkt in den Sialinsäure-Stoffwechselweg gelangen. Im Gegensatz dazu müssen peracetylierte Zucker durch intrazelluläre unspezifische Esterasen vollständig deacetyliert werden, bevor sie metabolisch aktiv werden. Obwohl sie bei niedrigeren Konzentrationen (typischerweise 10-50 μM) verwendet werden können, kann eine unvollständige Deacetylierung die Enzymaktivität beeinträchtigen oder zum Einbau von teilweise acetylierten Sialinsäure-Analoga führen, was die nachgelagerte Analyse möglicherweise verzerrt. Darüber hinaus kann die Freisetzung von Essigsäure den pH-Wert lokal beeinflussen, was sich möglicherweise auf die Zellfunktion auswirkt. Chen und Kollegen haben auch gezeigt, dass per-O-acetylierte Zucker über einen nicht-enzymatischen Mechanismus mit freien Cysteinresten in Proteinen reagieren, was zu einem Off-Target-Einbau und einem erhöhten unspezifischen Signal führt 17,18. In dem vorliegenden Protokoll beschäftigen wir daher ungeschützte ManNAc-Reporter.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Metabolisches Oligosaccharid-Engineering und Markierung von Sialinsäuren. UDP-GlcNAc wird durch die UDP-GlcNAc 2-Epimerase-Domäne von GNE/MNK im Zytosol in ManNAc umgewandelt. ManNAc wird dann im Zytosol durch die ManNAc 6-Kinase-Domäne von GNE/MNK zu ManNAc-6-phosphat phosphoryliert. Die N-Acetylneuraminat-Synthase katalysiert die Kondensation von ManNAc-6-P mit Phosphoenolpyruvat zur Herstellung von Neu5Ac-9-phosphat, das anschließend durch Sialinsäurephosphatase dephosphoryliert wird, um Neu5Ac zu erhalten. Neu5Ac kann auch über den Salvage-Weg über Endozytose und lysosomales Recycling zugeführt werden8. Nach dem Transport zum Zellkern wird es durch CMP-Sialinsäure-Synthetase in CMP-Neu5Ac umgewandelt. In der Golgi-Apparatur ist CMP-NeuAc das Substrat von Sialyltransferasen, die an den Endpositionen von Glykanen auf reifenden Glykokonjugaten eine Neu5A-Einheit einführen, die schließlich an der Zellmembran exprimiert oder sezerniert werden. ManNAz-Chemikalienreporter, die einen bioorthogonalen Griff tragen, können durch einen nicht identifizierten aktiven Transporter in die Zelle eindringen und in den Stoffwechselweg gelangen. Die markierten Neu5Az-Einheiten, die nach der Biosynthese in Glykane eingebaut werden, werden dann durch CuAAC-vermittelte Konjugation einer Fluoreszenzsonde markiert. Abkürzungen: NAc = N-Acetyl; UDP-GlcNAc = Uridindiphosphat N-Acetylglucosamin; ManNAc = N-Acetylmannosamin; GNE = UDP-GlcNAc 2-Epimerase; MNK = ManNAc 6-Kinase; ManNAc-6-P = ManNAc-6-phosphat; NANS = N-Acetylneuraminat-Synthase; PEP = Phosphoenolpyruvat; Neu5Ac = N-Acetylneuraminsäure; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-phosphat; NANP = Sialinsäure-Phosphatase; CMP = Cytidin-5′-Monophosphat; CMAS = CMP-Sialinsäure-Synthetase; STs = Sialyltransferasen; ManNAz = N-Azidoacetylmannosamine; Neu5Az = N-Azidoacetylneuraminsäure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Unter den möglichen bioorthogonalen Reaktionen konzentrierten wir uns auf die kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC)16,19. Nach unseren Erfahrungen ist CuAAC die beste Option für die Markierung intrazellulärer Glykane in fixierten Zellen. Diese Reaktion ist gut etabliert, in der bioorthogonalen Chemie gründlich untersucht und wurde für den Einsatz in komplexen biologischen Umgebungen standardisiert, was eine solide Wissensgrundlage und optimierte Protokolle bietet. Seine schnelle Kinetik bietet in der Tat eine hohe Reaktionseffizienz und Spezifität, und es handelt sich um Azid- und Alkingruppen, die leicht zu synthetisieren, stabil sind, in lebenden Systemen nicht vorkommen und gegenüber nativen Biomolekülen inert sind, was es ideal für Anwendungen mit festen Zellen macht, bei denen Kupfertoxizität kein Problem darstellt. Die stammgeförderte Alkin-Azid-Cycloaddition (SPAAC)20,21 vermeidet zwar Kupfertoxizität, hat aber eine langsamere Kinetik und voluminösere Sonden, was aufgrund des hydrophoben Fallens tendenziell zu einem höheren Hintergrundsignal und einem verringerten Signal-Rausch-Verhältnis für intrazelluläre Anwendungen führt, während der inverse Elektronenbedarf Diels-Alder (IEDDA)22,23, obwohl sie schnell und kupferfrei ist, erfordert eine komplexere Sondensynthese und erfordert sperrigere Reportergruppen, die in MOE-Anwendungen noch nicht vollständig charakterisiert wurden. Da für ExM ausschließlich fixierte Zellen benötigt werden, bietet CuAAC eine robuste und effiziente Lösung für die bioorthogonale Markierung.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Visualisierung intrazellulärer sialylierter Glykoproteine in Zellen vorgestellt, das metabolische Markierung, bioorthogonale Klickchemie und Expansionsmikroskopie kombiniert. In den in dieser Arbeit beschriebenen experimentellen Verfahren verwenden wir N-Azidoacetylmannosamin (ManNAz) als chemischen Reporter, und die CuAAC-Ligation von kleinen organischen Fluorophoren wird vor dem Expansionsverfahren durchgeführt. Glykoproteine werden vor der Gelierung, Verdauung und Expansion mit NAS am Hydrogel verankert. Die MOE-Markierung von Sialinsäuren kann mit Immunfluoreszenzansätzen zur Kolokalisationsbewertung assoziiert werden, wie hier am Beispiel eines Maus-Anti-GM130-Primärantikörpers, der im cis-Golgi-Apparat lokalisiert ist. Dieses Protokoll kann auf Zellen in ihrem physiologischen Zustand oder auf Zellen angewendet werden, die einer chemischen Behandlung unterzogen wurden. Um dies zu veranschaulichen, wurde Chloroquin verwendet, um die lysosomale Funktion zu hemmen, die die Verarbeitung und den Transport von Glykoproteinen innerhalb der Zellen beeinflusst. Die Kernfärbung wird als Meilenstein verwendet, nicht nur zur Lokalisierung von Zellen, sondern auch als Indikator für die Qualität des ExM-Prozesses. Der Expansionsfaktor kann in der Tat gemessen werden, indem man die Größe des Kerns vor der Expansion (preExM) und nach der Expansion (postExM) vergleicht.

<table><tbody><tr><td>(+) Natrium-L-Ascorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Zellkulturplatte</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Acrylsäure N-Hydroxysuccinimidester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Alkin&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1277-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Amoniumpersulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9913</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-067-100</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugationsröhrchen 2 mL</td><td>EPPENDORF</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquindiphosphatsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 12 mm #1</td><td>Epredia</td><td>CB00120RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 32 mm #1</td><td>Epredia</td><td>CB00320RA140MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0104-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Dutscher</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast 533T</td> <td>-</td><td></td> <td>Gesammelt von gesunden Individuen</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.9.0</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gelatine</td><td>Bio-RAD</td><td>170-6537</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50950</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Euromedex</td><td>PB0447-B</td><td>Wasserfrei</td></tr><tr><td>LSM 780 Konfokalmikroskopie&nbsp;</td><td>Zeiss-MCF7</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylmannosamine (ManNAc)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA05269</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td></td></tr><tr><td>N-Azidoacetylmannosamine (ManNAz)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA46002</td><td></td></tr><tr><td>Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Öl DIC M27</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-799&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>von&nbsp; Tritirachium-Album</td></tr><tr><td>, gereinigter Maus-GM130-Antikörper</td><td>BD Bioscience</td><td>610822</td><td>50 &micro; g</td></tr><tr><td>Natriumacrylat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>T75 Trinkflasche</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Acetat EDTA (TAE) 10x</td><td>Euromedex</td><td>EU0202-B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Dutscher</td><td>702630</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 1x</td><td>Dutscher</td><td>Nr. L0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung der intrazellulären sialylierung mit click-chemie und expansionsmikroskopie

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Im Folgenden ist die Anwendung des Protokolls zur Visualisierung von sialylierten Glykoproteinen in HeLa-Zellen (Abbildung 3A) und MCF7-Zellen (Abbildung 3B) dargestellt, wobei die CQ-Behandlung (Protokollabschnitt 2) und die Immunfluoreszenz-Colokalisationsfärbung (Protokollschritt 5.3) weggelassen werden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig03.jpg"> 
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Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

visualizing-intracellular-sialylation-with-click-chemistry-expansion

Research

Forschung

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Biology

Biologie

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Universelle molekulare Retention mit 11-facher Expansionsmikroskopie

Ein einzigartiges, umfassendes Protokoll zur Generierung von de-sialylierten humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mo-DCs) aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Sialidase-Behandlung wird vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden zur Beurteilung der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von mo-DCs beschrieben und evaluiert, wie die Behandlung mit Sialidase das Reifungsniveau von mo-DCs verbessert.

Generierung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen mit unterschiedlichen sialylierten Phänotypen

Erfahren Sie die Visualisierung intrazellulärer Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung von Glykokonjugaten ohne spezialisierte Superauflösungsmikroskope.

Visualisierung der intrazellulären Sialylierung mit Click-Chemie und Expansionsmikroskopie

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