Intraoperative Visualisierung der subretinalen Injektion und Netzhautablösung bei Ratten
7. März 2025
In diesem Artikel werden Methoden zur subretinalen Injektion bei Ratten beschrieben, bei denen intraoperative Visualisierung verwendet wird, um sowohl die Injektionsstelle als auch den Bereich der Netzhautablösung zu kontrollieren.
Ich erforsche die Mechanismen des Zelltods bei Netzhautablösungen und mein Ziel ist es, die Rückverfolgbarkeit von In-vitro-Daten auf In-vivo-Experimente zu gewährleisten. In unserem Team haben wir gezeigt, dass verschiedene Zelltodmechanismen während der Photorezeptordegeneration beteiligt sind. Es gibt viele Möglichkeiten, die beschrieben wurden, um eine Netzhautablösung bei Nagetieren zu induzieren.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um zwei Herausforderungen zu erfüllen: Reproduzierbarkeit und Sicherheit. Die Bereitstellung eines reproduzierbaren und sicheren Protokolls für die Netzhautablösung wird die Effizienz dieser Art von Forschung gewährleisten. Montieren Sie zunächst eine nicht abgeschrägte 10-Millimeter-Kanüle mit 30 Gauge, die auf einer 25-Mikroliter-Spritze zementiert ist, auf einen Mikroinjektor.
Um eine langfristige Netzhautablösung zu induzieren, verwenden Sie 2 % Hydroxypropylmethylcellulose oder 1 % bis 5 % Natriumhyaluronat. Laden Sie die vorbereitete Lösung in die Spritze. Tragen Sie anschließend einen Tropfen 0,5% Tropicamid auf ein Auge einer anästhesierten Ratte auf, um Mydriasis zu erhalten.
Tragen Sie einen Tropfen Oxybuprocain auf das zu operierende Auge auf. Verwenden Sie ein Ophthalmomikroskop, das mit einem Fußschalter verbunden ist, um die Operation durchzuführen. Um die Sklera freizulegen, verankern Sie zwei Augenlidziehnähte am äußeren Viertel des Lidrandes an den oberen und unteren Augenlidern.
Ziehen Sie an den Nähten, um eine sanfte Vorwölbung des Auges zu erreichen. Erzeugen Sie mit einer 30-Gauge-Nadel einen Skleralkanal durch die temporale bulbäre Bindehaut etwa ein bis zwei Millimeter vom Hornhautlimbus entfernt. Tragen Sie während des gesamten Eingriffs Tränengel als Linsen-Augen-Schnittstelle auf.
Um die Netzhautplatte sichtbar zu machen, platzieren Sie eine flache Kontaktlinse mit einem Durchmesser von acht Millimetern auf der Augenoberfläche. Verwenden Sie den Fußschalter des Mikroskops, um auf die Netzhautebene zu fokussieren. Führen Sie nun die Kanüle senkrecht durch den vorgeformten Skleralkanal ein.
Nähern Sie sich langsam der Netzhaut und drücken Sie sanft darauf, bis eine Netzhautaufhellung zu beobachten ist. Halten Sie die Stabilität der Spitze während der Injektion durch die Retiotomie aufrecht, die durch den Injektionsfluss gebildet wird. Entfernen Sie nach der Injektion die Spitze aus der Retinotomie. Ziehen Sie dann vorsichtig die gesamte Kanüle aus der Glaskörperhöhle heraus und stellen Sie sicher, dass die Linse nicht berührt wird.
Stellen Sie sicher, dass der Pupillenrotreflex durch die Netzhautablösung verändert wird, ohne den Blutfluss in der Glaskörperhöhle zu beobachten. Entfernen Sie die Lidnähte und tupfen Sie dann die Blutungen vorsichtig ab. Beurteilen Sie den Augeninnendruck kurz manuell.
Tragen Sie zur postoperativen Pflege die Chloramphenicol-Retinol-Augensalbe auf das operierte Auge auf. Verabreichen Sie dann einen Milliliter 5%iges Glukosemonohydrat intraperitoneal. Injizieren Sie 0,9 Milligramm pro Kilogramm Atipamezol subkutan.
Bringen Sie das Tier schließlich in eine klimatisierte Kammer und überwachen Sie es, bis es aufwacht. Die erfolgreiche subretinale Injektion wurde durch klare subretinale Flüssigkeit in der optischen Kohärenztomographie und das Fehlen von subretinalen Blutungen in der Fundusfotografie bestätigt. Und bei beiden Modalitäten wurde eine deutliche Netzhautablösung beobachtet.
Gelegentlich wurden kleinere intravitreale Blutungen beobachtet, vor allem in der Nähe der Injektionsstelle, die sich jedoch nicht bis in den subretinalen Raum erstreckten.
Übersicht
In diesem Artikel werden Methoden für subretinale Injektionen bei Ratten beschrieben, bei denen die intraoperative Visualisierung zur Kontrolle sowohl des Injektionsorts als auch des Bereichs der Netzhautablösung genutzt wird. Das Protokoll zielt darauf ab, die Reproduzierbarkeit und Sicherheit in der Forschung zur Netzhautablösung zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Forschung zur Netzhaut
- Experimentelle Protokolle
Hintergrund
- Verständnis der Zelltodmechanismen bei Netzhautablösungen.
- Bedeutung der Rückverfolgbarkeit von In-vitro- zu In-vivo-Daten.
- Herausforderungen bei der Gewährleistung von Reproduzierbarkeit und Sicherheit in experimentellen Verfahren.
- Verschiedene Methoden zur Induktion einer Netzhautablösung bei Nagetieren.
Zweck der Studie
- Eine reproduzierbare und sichere Methode für die Ablatio retinae bereitzustellen.
- Die effiziente Erforschung der Netzhautdegeneration zu erleichtern.
- Die Genauigkeit chirurgischer Techniken für subretinale Injektionen sicherzustellen.
Verwendete Methoden
- Montage einer nicht abgeschrägten Kanüle an einem Mikroinjektor.
- Verwendung von Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumhyaluronat zur Ablösung der Netzhaut.
- Durchführung der Operation am okularen Mikroskop.
- Injektion über einen vorformierten skleralen Kanal und Beurteilung der Ergebnisse mittels optischer Kohärenztomographie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche subretinale Injektion, bestätigt durch klare subretinale Flüssigkeit.
- Fehlen einer subretinalen Blutung, beobachtet in der Fundusfotografie.
- Deutliche Netzhautablösung durch bildgebende Verfahren bestätigt.
- Kleine intravitreale Blutungen festgestellt, die sich jedoch nicht in den subretinalen Raum ausdehnten.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert die Sicherheit und Reproduzierbarkeit von Studien zur Netzhautablösung.
- Die visuelle Bestätigung erfolgreicher Injektionen ist entscheidend für die Gültigkeit der Forschung.
- Die postoperative Versorgung ist für das Wohlergehen und die Genesung der Tiere unerlässlich.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die intraoperative Visualisierung der subretinalen Injektion und der Netzhautablösung bei Ratten trägt einem entscheidenden Bedürfnis nach reproduzierbarer und kontrollierter Applikation von Wirkstoffen sowie der Modellierung von Erkrankungen in der Augenheilkundlichen Wirkstoffforschung Rechnung. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Manipulation und Überwachung der Netzhautablösung und unterstützt so die translationale Kontinuität von präklinischen Modellen zu menschlich relevanten Arbeitsabläufen. Eine verbesserte Reproduzierbarkeit und Sicherheit wirkt sich direkt auf die Vorhersagegenauigkeit von Therapieprogrammen für Netzhauterkrankungen in frühen Entwicklungsstadien aus.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine kontrollierte Induktion einer Netzhautablösung für mechanistische Untersuchungen des Photorezeptorverfalls.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung therapeutischer Zielstrukturen im subretinalen Raum.
- Erleichtert die reproduzierbare Modellierung von Erkrankungen für hypothesengeleitete Forschung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes In-vivo-System zur Bewertung der subretinalen Applikation von Testsubstanzen.
- Gewährleistet die quantitative Beurteilung des Injektionserfolgs mittels bildgebender Verfahren.
- Standardisiert das Vorgehen, um konsistente Assay-Ergebnisse über verschiedene Studien hinweg zu erzielen.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft präklinische Modelle der Netzhautablösung mit klinischen Verfahren, um die Übertragbarkeit zu gewährleisten.
- Ermöglicht die Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit und Sicherheit unter kontrollierten, reproduzierbaren Bedingungen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Netzhauttherapien basierend auf robusten In-vivo-Daten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung bei Netzhauterkrankungen integriert, verbindet in-vitro-Ergebnisse mit in-vivo-Validierung und unterstützt die Identifizierung sowie Optimierung von Leitverbindungen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zu Zelltodmechanismen und Zielstrukturen in Netzhautgewebe.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantifizierbare Messwerte zur Evaluierung von Substanzen in einem klinisch relevanten Modell.
- Analysen: Verwendet Fundusfotografie und optische Kohärenztomografie zur objektiven Beurteilung der Ergebnisse von Injektionen und Ablösungen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Zusammenhang zwischen Nagetiermodellen und menschlichen chirurgischen Eingriffen zur subretinalen Applikation.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Legt einen standardisierten, auf verschiedene Netzhautforschungsprogramme und therapeutische Verfahren übertragbaren Protokollrahmen fest.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung retinaler Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit, Sicherheit und Standardisierung von In-vivo-Verfahren an der Retina.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz in ophthalmologischen Forschungs- und Entwicklungsportfolios.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung retinaler therapeutischer Kandidaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der mikrochirurgischen Augenheilkunde und der Anästhesie an Nagetieren.
- Setzt den Zugang zu augenärztlichen Mikroskopen, Mikroinjektoren und Bildgebungssystemen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Forschungsteams hinweg, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Kann je nach spezifischen Forschungszielen an unterschiedliche Dauern der Netzhautablösung und Viskositäten der Lösungen angepasst werden.
- Mögliche Einschränkungen beinhalten das Risiko von Linsenschäden, Blutungen oder einem Fehlschlagen der Ablösung, weshalb eine sorgfältige Einhaltung des Verfahrens erforderlich ist.
