Name: Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie ein kostengünstiges Hochauflösungs-Protokoll zur Quantifizierung von Wachstums- und Musterdefekten in adulten Drosophila-Augen. Diese Methode ermöglicht zugängliche Mikroskopie für Krebsforschung.

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1. Entnahme und Fixierung adulter Drosophila
<ol>
	<li>Setzen Sie Drosophila-Kreuzungen ein oder wählen Sie Stämme aus und legen Sie sie in Fläschchen mit Fliegenfutter. Inkubieren Sie die Fläschchen bei der gewünschten Temperatur (in der Regel 25 °C), bis sich die Fliegen entwickelt haben und die erwachsenen Tiere sich einschließen (~10-14 Tage bei 25 °C).</li>
	<li>Betäuben Sie die Fliegen mit CO2 und legen Sie sie auf ein CO2 -Pad.</li>
	<li>Sortieren Sie die Fliegen mit einer Feder und wählen Sie die Individuen mit dem gewünschten Phänotyp (z.B. gerade Flügel) aus. Stellen Sie einen Federfliegensortierer her, indem Sie eine Gänsefeder so zuschneiden, dass sie in das konische Ende einer serologischen 1-ml-Pipette passt.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 70%igem Ethanol vor. Legen Sie die ausgewählten Fliegen in das Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie auf Eis. Lagern Sie die Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht bei 4 °C (Abbildung 2A). HINWEIS: Bewahren Sie Fliegen nicht länger als 24 Stunden in Ethanol auf. Die langfristige Lagerung von Fliegen in 70%igem Ethanol führt zum Verlust von Augen- und Körperpigmenten.</li>
</ol>
2. Probenvorbereitung durch Punktmontage
HINWEIS: Drosophila sind Insekten mit weichem Körper, die spröde werden und an der Luft zusammenfallen; Daher erfordert dieses Protokoll, dass die Proben am selben Tag abgebildet werden, an dem sie montiert werden. Arbeiten Sie in kleinen Sets von ~5 Fliegen auf einmal, um Probenverluste zu vermeiden. Erhöhen Sie die Anzahl der Proben in einem Satz basierend auf der Effizienz. Proben, die mehr Zeit vor der Bildgebung benötigen, können durch eine zunehmende Konzentrationsreihe von Hexamethyldisilazan (HMDS) dehydriert werden14.
<ol>
	<li>Schneiden Sie kleine dreieckige Spitzen (7,1 mm x 2,7 mm) aus 65 lb Archivkarton mit einem speziellen Punktlocher aus. Bereiten Sie Punkte vor, indem Sie die Spitze (schmalste 25%) mit der Dumont #5 Feinpinzette in einen 90°-Winkel biegen (Abbildung 2B).</li>
	<li>Entfernen Sie mit der Dumont #5 Feinpinzette die Fliegen aus den Mikrozentrifugenröhrchen (Schritt 1.4). Tupfen Sie die Fliegen vorsichtig mit fusselfreiem Laborgewebe ab, um überschüssiges Ethanol zu entfernen. Positionieren Sie jede Fliege auf der linken Seite auf einer Karteikarte unter einem Präpariermikroskop. HINWEIS: Entfernen Sie die Fliegen aus der Röhre, indem Sie sich an einer anatomischen Struktur festhalten, die nicht der interessierende Bereich ist - bei der Abbildung des Kopfes halten wir die Proben am Flügel oder Bein. Halten Sie die Proben nicht am Bauch, da diese Struktur verwendet wird, um die Fliege auf die Kartenspitze zu kleben.</li>
	<li>Bereiten Sie den Hautkleber vor und stellen Sie seine Konsistenz auf die gewünschte Viskosität ein. Mischen Sie 1-2 Tropfen Hautkleber mit 1-2 Tropfen deionisiertem (DI) Wasser und mischen Sie es mit einer Transferpipette auf einer Karteikarte. Nehmen Sie eine vorbereitete Kartenspitze am breiten Ende mit einer Pinzette auf und geben Sie eine kleine Menge des verdünnten Klebers auf die gebogene Spitze der Spitze, indem Sie ihn in die Leim-Wasser-Mischung tupfen (Abbildung 2C). HINWEIS: Der Kleber sollte streichbar, aber nicht flüssig sein.</li>
	<li>Bringen Sie die gebogene Spitze der Spitze auf die vordere Seite des rechten Abdomens um die Bauchsegmente 2-3 an (Abbildung 2C). Bevor der Kleber trocknet, nehmen Sie leichte Anpassungen am Hosenschlitz vor, so dass die vorder-hintere Achse des Fliegens senkrecht zur gebogenen Spitze der Spitze steht.</li>
	<li>Stecken Sie einen Befestigungsstift Nr. 3 in das breite Ende der Kartenspitze (Abbildung 2D) und befestigen Sie ihn an einem Insektenstiftblock (Abbildung 2E). Beschriften Sie jeden Pin oder jede Pin-Reihe mit dem entsprechenden Genotyp.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Probenvorbereitung. (A) Adulte Drosophila werden nach phänotypischen Markern sortiert und in markierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol auf Eis gesammelt. Die Fliegen werden bei 4° C über Nacht gelagert. (B) Papierkartenspitzen werden vorbereitet, indem das schmale Ende mit einer Pinzette #5 um 90° vom Rest der Karte gebogen wird. (C) Fliegen werden aus den Röhren geborgen und kurz an der Luft trocknen gelassen. Hautkleber wird auf das kleine, gefaltete Ende der vorbereiteten Kartenspitze aufgetragen und an den Bauchsegmenten 2-3 auf die adulte Fliege geklebt. (D) Die Proben werden mit einem Identifikationsetikett auf einen Insektenstift #3 aus Edelstahl montiert. (E) Gesteckte Proben werden auf einer Probenplatine gelagert, bis sie für die Bildaufnahme bereit sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
3. Hochauflösende Fokus-Stacking-Bildaufnahme
<ol>
	<li>Erfassen Sie hochauflösende Fotos von Fliegenaugen mit einem zusammengebauten und individuell angepassten Focus-Stacking-Bildgebungssystem.<ol>
		<li>Nehmen Sie Fotos mit einem DSLR-Kameragehäuse mit einem 70-200-mm-Teleobjektiv auf, das über einen 77-mm-Objektivadapter mit einem 20-fach-Apo-Mikroskopobjektiv verbunden ist.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Probe durch einen Diffusor mit einem Blitz beleuchtet wird (Abbildung 3).</li>
		<li>Steuern Sie die Z-Positionierung mit einem Stackshot-Controller und einer Makroschiene.</li>
		<li>Verbinden Sie die Kamera, den Blitz und den motorisierten Tisch mit einem robusten Stativ aus eloxiertem Aluminium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Positionieren Sie jede punktgebundene Probe auf einem universellen Tisch-Gimbal, wobei der Kopf so ausgerichtet ist, dass das Auge zur Linse zeigt. Passen Sie die Kopfposition an, indem Sie den Kopf vorsichtig mit der Pinzette bewegen. ACHTUNG: Große und schnelle Anpassungen können zu einer versehentlichen Enthauptung führen.</li>
	<li>Wenn die Kamera an einen Laptop angeschlossen ist, passen Sie die Aufnahmeeinstellungen in der Software an. Fotografieren Sie Proben bei 20-facher Vergrößerung mit diesen Einstellungen: Blitzleistung 1/32, Verschlusszeit 1/200, Blende F2,8 und ISO 400. Stellen Sie sicher, dass alle Autofokus- und Bildstabilisierungsfunktionen deaktiviert sind. HINWEIS: Diese Einstellungen sorgen für ein ausgewogenes Verhältnis zwischen optimaler Blitzbeleuchtung, Verschlusszeit und Schärfentiefe. Sie müssten für andere Vergrößerungen und/oder Linsenkombinationen angepasst werden.</li>
	<li>Legen Sie den Speicherort für den resultierenden Bildstapel (10-50 Bilder) im gewünschten Dateiordner fest. Stellen Sie sicher, dass genügend Speicherkapazität für die Bilder vorhanden ist (~8,5 MB pro Bild).</li>
	<li>Passen Sie die Einstellungen für den Fokusstapel an der Stackshot-Steuereinheit im Auto-Distance-Modus an. <ol>
		<li>Stellen Sie die Schrittweite auf 5 μm ein und berechnen Sie die Anzahl der Schritte , indem Sie die Start - und Stopppositionen des Fokusstapels festlegen.</li>
		<li>Betrachten Sie die Probe im LiveView-Modus und mit der Kamera im Auto-Shoot-Modus , um die Start- und Stopppositionen zu identifizieren.</li>
		<li>Bewegen Sie die Schiene so, dass der nächstgelegene Teil der Probe scharf ist ( Startposition einstellen), und bewegen Sie sich dann dorthin, wo das am weitesten entfernte interessierende Merkmal scharf ist ( Endposition einstellen).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Versetzen Sie die Kamera wieder in den manuellen Aufnahmemodus und starten Sie die Bildaufnahme über die Stackshot-Steuereinheit. HINWEIS: Die Bildaufnahmezeit hängt von der Größe der Probe ab. Je größer die Schärfentiefe, die für große Proben erforderlich ist, desto mehr Schichten werden in den Bildstapel aufgenommen, was die Gesamtaufnahmezeit verlängert.</li>
	<li>Öffnen Sie Dateien in der referenzierten Focus-Stacking-Software. Generieren Sie ein gestapeltes Bild, indem Sie auf Stapeln | Ausrichten &amp; Stapeln aller (PMax).</li>
	<li>Speichern Sie das endgültige Bild als .tif Datei auf der Festplatte des Computers, indem Sie auf Datei | Ausgabebild speichern. HINWEIS: Abhängig von der Auflösung der gestapelten Image-Datei und der Anzahl der abgebildeten Exemplare können große externe Festplatten (1 TB) für die Image-Sicherung erforderlich sein. Bei diesem Protokoll sind gestapelte Bilder jeweils ca. 100 MB groß, bevor sie komprimiert werden.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Bildaufnahme. (A) Bildgebende Vorrichtung mit Teilen mit der folgenden Bezeichnung: a) Gehäuse der DSLR-Kamera; b) Teleobjektiv; c) 20x Apo Mikroskop Objektiv und Adapter; d) Blitz; e) Linsen- und Kuppeldiffusoren; f) Stackshot-Controller, Makroschiene und Drehtisch; g) Universelles Bühnen-Gimbal; h) Stativ. (B) Bildgebendes Gerät mit eingesetztem Lichtdiffusor. (C) Nahaufnahme einer montierten Probe in Position für die Bildgebung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
4. FIJI-Analyse-Workflow zur Berechnung der Augenpartie bei Erwachsenen
<ol>
	<li>Für die Bildanalyse laden Sie die FIJI-Software15 von der ImageJ.net-Website herunter.</li>
	<li>Wählen Sie Bilder für die Analyse aus, bei denen das Auge zentriert und ausgerichtet ist, mit angemessener Beleuchtung und minimaler peripherer Unschärfe, was auf eine korrekte Ausrichtung mit der Kamera hinweist.</li>
	<li>Kalibrieren Sie den Bildmaßstab.<ol>
		<li>Laden Sie das Bild der Maßstabsleiste für eine 20-fache Vergrößerung herunter, die 500 μm entspricht. Alternativ können Sie zum Zeitpunkt der Bildaufnahme ein Lineal mit denselben Einstellungen fotografieren. Öffnen Sie das Bild in der FIJI-Software.</li>
		<li>Messen Sie die Länge der Maßstabsleiste (Abbildung 4A). Verwenden Sie das Werkzeug "Gerade Linie ", um die Linie genau nachzuzeichnen. Klicken Sie auf Analysieren | Messen. Dieser Pixelabstand entspricht 500 μm (Abbildung 4B).</li>
		<li>Berechnen Sie Pixel pro Mikrometer. Verwenden Sie diese Option, um Pixelmessungen in Mikrometermessungen umzuwandeln.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Öffnen Sie die gestapelte Bilddatei in FIJI (Abbildung 4C).</li>
	<li>Wählen Sie Lupe aus der Symbolleiste, um den Fokusbereich zu vergrößern. Versuchen Sie, den Bildschirm mit dem Auge und der unmittelbar umgebenden Nagelhaut des Kopfes auszufüllen (Abbildung 4D).</li>
	<li>Wählen Sie Freihandwerkzeug aus der Symbolleiste aus. Umreißen Sie den Netzhautbereich so genau wie möglich und folgen Sie dabei den Konturen der äußersten Reihe von Ommatidien (Abbildung 4E). Um einen Teil der Auswahl zu entfernen, halten Sie die Optionstaste gedrückt und wählen Sie die Pixel aus, die Sie entfernen möchten. Um der Auswahl etwas hinzuzufügen, halten Sie die Wahltaste und die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie die Pixel aus, die Sie hinzufügen möchten.</li>
	<li>Um die Fläche zu berechnen, wählen Sie Analysieren | Messen Sie über das obere Menü (Abbildung 4F). Es erscheint ein neues Fenster mit den Parametern Fläche, Mittelwert, Minimum und Maximum . Kopieren Sie diese Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, um sie zu dokumentieren und von Pixeln in Mikrometermessungen umzuwandeln.</li>
	<li>Führen Sie entsprechende statistische Analysen durch.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Bildanalyse in Fidschi. (A) Skalieren Sie das Originalbild. Laden Sie das Kalibrierbild herunter und messen Sie die Länge des 500-μm-Stabs. (B) Passen Sie die Skalierung mit der Funktion "Skalierung einstellen " an. (C) Öffnen Sie das gestapelte Bild. (D) Vergrößern Sie das Bild so, dass das Auge zentriert und nahezu im Vollbildmodus angezeigt wird. (E) Verwenden Sie das Freihandauswahl-Werkzeug , um das Auge an der Grenze zwischen der äußersten Reihe der Ommatidien und der umgebenden Nagelhaut zu umranden. (F) Messen Sie die Fläche innerhalb des ausgewählten Bereichs wird berechnet, indem Sie auf Analysieren | Messen | Fläche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Hochauflösende Bildgebung und Analyse von Drosophila-Augendefekten

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</ol>

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiger genetischer Modellorganismus, der seit Jahrzehnten zur Aufklärung molekularer Signalwege und zellulärer Verhaltensweisen eingesetzt wird. Viele der evolutionär konservierten Signalwege, die für die multizelluläre Entwicklung essentiell sind, wurden erstmals in Drosophila identifiziert und ihr Wirkmechanismus definiert. Etwa 65-75% aller humanen krankheitsassoziierten Gene haben Orthologe in Drosophila 1,2. Das erwachsene Drosophila-Auge ist ein wichtiges Modell, das unvoreingenommene genetische Screenings ermöglicht hat, die die Entdeckung wichtiger konservierter Gene erleichtern, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, einschließlich Krebs 3,4, Neurodegeneration5 und Stoffwechselstörungen6.
Das Drosophila-Auge besteht aus ~800 Augeneinheiten, die als Ommatidien bezeichnet werden und präzise in einem sechseckigen Muster über die Oberfläche des erwachsenen Auges angeordnet sind7. Jedes Ommatidium besteht aus acht Photorezeptorneuronen, die eine unterschiedliche Position innerhalb eines asymmetrischen Trapezes einnehmen. Diese werden von vier nicht-neuralen Zapfenzellen und zwei primären Pigmentzellen unterstützt, die Linsen und Pseudokegel sezernieren, um Licht auf die lichtempfindlichen Rhabdomeren der Photorezeptorneuronen zu fokussieren. Benachbarte Ommatidien sind durch eine einzige Reihe interommatidialer Gitterzellen getrennt, die aus sekundären Pigmentzellen, tertiären Pigmentzellen und mechanosensorischen Borstenkomplexen bestehen 8,9,10.
Störungen in der Augenentwicklung sind bei erwachsenen Augen als Zunahme oder Verminderung der Augengröße, abnormale Häufigkeit oder Struktur von Linsen oder Borsten oder als "raues Auge" sichtbar, bei dem die normalerweise invariante sechseckige Musterung gestört ist, so dass eine Reihe von Ommatidien nicht mehr über die Oberfläche des Auges verfolgt werden kann. Diese Phänotypen können mit Hilfe von Präpariermikroskopen auf der Ebene des groben Gewebes bewertet werden. Die detaillierte Analyse von Phänotypen umfasst traditionell die Rasterelektronenmikroskopie, gefolgt von einer quantitativen Bildanalyse11. Die Rasterelektronenmikroskopie erfordert jedoch teure Instrumente, teure Reagenzien, eine tagelange Probenvorbereitung und oft Vollzeitpersonal für die Wartung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig01v2.jpg"> 
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Bildgebung adulter Drosophila-Strukturen . (A) Adulte Drosophila in 70 % Ethanol sammeln und fixieren. (B) Bereiten Sie die Proben für die Bildgebung vor, indem Sie sie punktuell montieren und an Stiften befestigen. (C) Erfassen Sie hochauflösende Bilder durch Fokus-Stacking und Integration. (D) Quantifizieren Sie Bilder mit FIJI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
In diesem Artikel wird ein Arbeitsablauf vorgestellt, der relativ kostengünstig ist, eine kurze Probenvorbereitungszeit hat, leicht auf einem 3-Fuß-Labortisch eingerichtet werden kann, keine gefährlichen Materialien erfordert und eine langlebige Ergänzung für Drosophila-Forschungslabore sein könnte (Abbildung 1). Die Punktbefestigung ist eine entomologische Technik, die zur Lufttrocknung und Konservierung von kleinen, weichen Insekten wie Drosophila12 verwendet wird. Bei dieser Methode werden Mikroskopobjektive mit hochauflösenden DSLR-Kameras kombiniert, um effektive Vergrößerungen von 10x bis 1.000x zu erzielen. Die begrenzte Schärfentiefe, die der Makrofotografie eigen ist, wird durch Focus Stacking überwunden: Das Zusammenfügen einer Reihe von Bildern, wobei sich die Brennebene durch das interessierende Exemplar bewegt13. Diese Methode liefert hochauflösende Bilder, die sich für die Quantifizierung von Phänotypen eignen und leicht für andere interessante Strukturen wie Flügel, Bein, Thorax und Abdomen angepasst werden könnten. Für den Bildanalyse-Workflow wird das kostenlose Bildanalyseprogramm FIJI (NIH ImageJ) verwendet. Diese Methodik macht die Probenvorbereitung, hochauflösende Bildgebung und Analyse für Studenten und Wissenschaftler an unterversorgten Institutionen zugänglich.

<table><tbody><tr><td>1 mL serologische Pipette</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170353N</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-282LR</td><td></td></tr><tr><td>20x Apo Mikroskop Objektiv</td><td>Mitutoyo Corp.</td><td>378-804-3</td><td></td></tr><tr><td>Archival 65 lb Karton&nbsp;</td><td>Neenah, Inc.</td><td>91901</td><td></td></tr><tr><td>Canon EF 70-200 mm USM II Teleobjektiv</td><td>Canon</td><td>3044C002</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D Mark II DSLR Kameragehäuse</td><td>Canon</td><td>1897C002</td><td></td></tr><tr><td>Diffusor Dome</td><td>Makroskopische Lösungen&nbsp;</td><td>PA-DIF-GIM-SM</td><td></td></tr><tr><td>Diffusor für Mitutoyo M Plan APO Objektive</td><td>Makroskopische Lösungen&nbsp;</td><td>mitutoyo-diffusoren</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Fläschchen und Stopfen</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>32-117BF</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten mit feiner Spitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9889584</td><td></td></tr><tr><td>Gänsefedern</td><td>Amazon</td><td>B01CMMJI6U</td><td></td></tr><tr><td>robustes stativ aus eloxiertem Aluminium</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>TFA-32G</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>fusselfreies Laborgewebe</td></tr><tr><td>Levenhuk M1000 Plus Digitalkamera</td><td>Levenhuk</td><td>70358</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 3 Befestigungsstift</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-3</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Bloomington Drosophila media</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>66-113</td><td>Fliegenfutter</td></tr><tr><td>Point-Punch</td><td>M.C. Mieth Manufacturing, Inc.</td><td>448Detail</td><td></td></tr><tr><td>Screwknob Clamp</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>SK-Clamp</td><td>Zur Befestigung der Makroschiene am Stativ</td></tr><tr><td>Stackshot Controller und Makroschiene</td><td>Cognisys Inc.</td><td></td><td></td>ST3X_100_BUNDLE</tr><tr><td>Schrittring-Adapter&nbsp;</td><td>RAF Camera</td><td>763461174207</td><td>Objektivadapter zum Verbinden des Mikroskopobjektivs mit dem Kameraobjektiv</td></tr><tr><td>Titebond Glue</td><td>Franklin International</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash</td><td>Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.</td><td>YN-24EX</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS Utility (v. 3.16.1).&nbsp;</td><td>Die Canon</td><td></td><td>Akquisitionssoftware</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>National Institutes of</td><td></td><td>Health Fiji wird als Open Source unter der GNU General Public License veröffentlicht. Fidschi Version 2.14.0/1.54f&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA</td><td></td><td>Prism Version 10.3.1</td></tr><tr><td>Zerene Stacker (v.1.04)</td><td>Zerene Systems, LLC</td><td></td><td>Focus Stacking Software</td></tr></tbody></table>

ein schneller, einfacher workflow zur quantifizierung externer adulter drosophila-strukturen

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

Das Drosophila-Auge ist ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung von Gewebemustern, Wachstumskontrolle und Zelltod. Wir haben kürzlich eine Studie veröffentlicht, in der untersucht wurde, wie der intrazelluläre pH-Wert (pHi) das Gewebewachstum beeinflusst. Zunächst etablierten wir ein genetisches System, bei dem die Überexpression des Natrium-Protonen-Austauschers DNhe2 (das Ortholog des Säugetier-NHE1) im sich entwickelnden Auge zu Musterungsdefekten und erhöhter Proliferation führt16. Eine erhöhte Proliferation mit höherem pHi wird bei allen Spezies von Hefen bis hin zu Säugetieren beobachtet17. Wir beobachteten jedoch auch, dass das erwachsene Auge bei erhöhtem pHi im Vergleich zu den Kontrollen kleiner erschien.
Eine quantitative Analyse der adulten Augenpartie wurde durchgeführt, um zu bestimmen, wie eine erhöhte DNhe2-Expression die Gewebegröße im Drosophila-Auge verringert. Wir haben zunächst Bilder mit niedriger Auflösung mit einem Okulareinsatzmikroskop aufgenommen (Abbildung 5A), aber diese waren von unzureichender Qualität, um quantitative Messungen durchzuführen. Insbesondere werden die Augenränder nicht scharf gestellt, was eine genaue Messung der Augenpartie verhindert.
Wir maßen die Fläche jedes Auges in hochauflösenden Bildern von erwachsenen Drosophila-Augen (Abbildung 5B). GMR&gt;DNhe2-exprimierende Fliegen hatten signifikant kleinere Augen (Mittelwert 74,28μm 2) als die genetische Hintergrundkontrolle mit1118 Fliegen (Mittelwert 125,83 μm2) oder die Treiberkontrolle GMRGAL4 heterozygote Fliegen (Mittelwert 142,49 μm2), was einer Flächenreduzierung von 41 % bzw. 48 % entspricht (Abbildung 5C). Diese Abnahme der Augengröße trotz erhöhter Proliferation könnte auf einen erhöhten Zelltod zurückgeführt werden.
Bekannte Autophagie-Gene, einschließlich Atg1, das die Phagophorbildung induziert, wurden in genetischen Interaktionsstudien verwendet (Abbildung 5). Die Auswirkungen auf die Augengröße bei Erwachsenen wurden mit hochauflösender Fotografie und Flächenanalyse quantifiziert (Abbildung 5B). Die Augengröße war bei GMR&gt;DNhe2-Fliegen, die für Atg13 heterozygot waren, im Vergleich zu GMR&gt;DNhe2 allein wiederhergestellt (129,9μm 2 vs. 74,28 μm2) und war ähnlich wie bei Kontrollen (Abbildung 5C). In Kombination mit der molekularen Markeranalyse unterstützen unsere Ergebnisse einen erhöhten autophagischen Zelltod bei höherem pHi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Rettung einer verminderten Netzhautgröße in Verbindung mit einem erhöhten intrazellulären pH-Wert mit verminderter Autophagie. (A) Niedrig aufgelöste Bilder von erwachsenen Fliegenaugen, die mit einem Okulareinsatzmikroskop aufgenommen wurden. (B) Hochauflösende Bilder von adulten Fliegenaugen, die zur Quantifizierung der Augengröße für die folgenden Genotypen verwendet wurden: w1118; GMRGAL4; GMR&gt;DNhe2; GMRGAL4; Atg13; GMR&gt;DNhe2; Atg13. (C) Die durchschnittlich gemessenen Augengrößen bei Erwachsenen waren: w 1118 (125,83 μm2, N = 7); GMRGAL4 (142,49 μm2, N = 9) und GMR&gt;DNhe2 (74,28 μm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146,4 μm2, N = 15); GMR&gt;DNhe2; Atg13 (129,9 μm2, N = 19) und wird durch die Darstellung von Medianwerten mit Interquartilsabständen angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde durch ungepaarte t-Tests mit Welch-Korrektur bestimmt. Die Daten in B und C wurden zuvor veröffentlicht18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Unsere Schlussfolgerungen werden durch die Probenvorbereitung, die hochauflösende Bildgebung und die hier beschriebene Analyse untermauert. Diese Methoden ermöglichten eine präzise und quantitative Beschreibung der Größe adulter Drosophila-Augen mit verschiedenen Genotypen. Wir verwenden diesen Ansatz weiterhin, um andere genetische Interaktionen zu bewerten, die die Mechanismen der pH-abhängigen Wachstumskontrolle aufklären werden.

Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Drosophila-Flugmuskeln werden als Modellsystem für Muskelentwicklung und Physiologie verwendet. Dieses Video beschreibt die Flugmuskulatur von Erwachsenen und zeigt ein Protokoll zur Dissektion der sich entwickelnden indirekten Flugmuskulatur, die für die RNA-Sequenzierung von Puppen geeignet ist.

Drosophila Dissektion des späten indirekten Flugmuskels (IFM): Eine Methode zur Gewebeentnahme mit hohem Durchsatz

Morphologie, Größe und Lage intrazellulärer Organellen sind evolutionär konserviert und scheinen ihre Funktion direkt zu beeinflussen. Die molekularen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen, zu verstehen, ist zu einem wichtigen Ziel der modernen Biologie geworden. Hier zeigen wir, wie diese Studien durch die Anwendung quantitativer Techniken erleichtert werden können.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Der erwachsene Drosophila Gehirn ist ein wertvolles System zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, höhere Hirnfunktionen und komplexe Erkrankungen. Eine effiziente Methode ganze Hirngewebe von der kleinen Fliegenkopf zu sezieren werden Gehirn basierte Studien erleichtern. Hier beschreiben wir eine einfache, one-step-Dissektion Protokoll von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Zwei Bildanalysealgorithmen, „Drosophila NMJ Morphometrie“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ wurden geschaffen, um automatisch neun morphologischen Merkmale der neuromuskulären Synapse Drosophila zu quantifizieren (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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Dieses Protokoll beschreibt einen In-vivo-Test der Phagozytose zur Beurteilung und Quantifizierung der Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten an Phagozytosebakterien..

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Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Erfahren Sie ein kostengünstiges Hochauflösungs-Protokoll zur Quantifizierung von Wachstums- und Musterdefekten in adulten Drosophila-Augen. Diese Methode ermöglicht zugängliche Mikroskopie für Krebsforschung.

Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

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