Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

Unser Labor ist daran interessiert zu verstehen, wie die intrazelluläre pH-Dynamik das zelluläre Verhalten moduliert. Wir interessieren uns für Verhaltensweisen, die zum Fortschreiten von Krebs beitragen, da wir wissen, dass der intrazelluläre pH-Wert bei den meisten Krebsarten erhöht ist. Wir machen viel Mikroskopie und entwickeln Protokolle, um Daten aus diesen Bildern zu quantifizieren.

Wir lernen mehr über zelluläre Signalwege und Prozesse, die durch den pH-Wert reguliert werden. Die meisten Krebszelllinien haben einen höheren intrazellulären pH-Wert und viele zeigen ein erhöhtes Maß an Autophagie, aber wir wussten nicht, dass dies zusammenhängt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass ein höherer intrazellulärer pH-Wert in genetisch normalen Zellen ausreicht, um die Autophagie zu erhöhen.

Unser Labor ist eines der wenigen Labore, die untersuchen, wie der intrazelluläre pH- oder PHI-Wert das Zellverhalten in einem Ganztiermodell reguliert. Wir haben herausgefunden, dass ein erhöhter PHI eine erhöhte Zellproliferation, invasive Zellmigration und Gewebedesorganisation fördert. Zuletzt haben wir herausgefunden, dass ein höherer PHI die Autophagie fördert, eine Form des zellulären Kannibalismus.

Wir schließen die Lücke, die durch die hohen Kosten und die Komplexität der Vorbereitung von Proben für das REM entstanden ist, die die Zugänglichkeit für viele Labore einschränkt. An der San Jose State University fehlen uns die Ressourcen für SEM. Deshalb haben wir ein zugänglicheres und erschwinglicheres Protokoll entwickelt, das es uns ermöglicht, die hochauflösenden Bilder ohne teure Ausrüstung aufzunehmen.

Dieses Protokoll kombiniert traditionelle Techniken, die in der Entomologie verwendet werden, und bietet eine kostengünstige und benutzerfreundliche Alternative zur Rasterelektronenmikroskopie. Es kann leicht angepasst werden, um hochauflösende Bilder von verschiedenen Teilen der Fliege oder verschiedenen Exemplaren aufzunehmen. Wählen Sie zunächst den gewünschten Drosophila-Stamm aus und legen Sie ihn in ein Fläschchen mit Fliegenfutter.

Inkubieren Sie das Fläschchen bei 25 Grad Celsius, bis die Fliegen gewachsen sind und die erwachsenen Tiere in der Nähe sind. Als nächstes betäuben Sie die erwachsenen Fliegen mit Kohlendioxid und legen Sie sie auf ein Kohlendioxid-Pad. Bereiten Sie einen Federfliegensortierer vor, indem Sie eine Gänsefeder so zuschneiden, dass sie in das konische Ende einer serologischen Ein-Milliliter-Pipette passt.

Sortieren Sie die Fliegen mit einer Feder und wählen Sie die Individuen mit geraden Flügeln aus. Geben Sie anschließend einen Milliliter 70%iges Ethanol in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Setze die ausgewählten Fliegen in die Tube um und lege die Tube auf Eis.

Mit einem speziellen Punktlocher. Schneiden Sie kleine dreieckige Spitzen aus 65 Pfund Archivkarton aus. Verwenden Sie dann die Dumont-Pinzette mit der feinen Spitze Nummer fünf, um die Spitze jeder Spitze in einem 90-Grad-Winkel zu biegen.

Entfernen Sie die Fliegen aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Dumont Zange mit fünf Feinspitzen. Tupfen Sie die Fliegen vorsichtig mit fusselfreiem Tuch ab, um überschüssiges Ethanol zu entfernen. Lege jede Fliege auf ihre linke Seite auf eine Karteikarte unter ein Präpariermikroskop.

Mischen Sie mit einer Transferpipette ein bis zwei Tropfen Hautleim mit ein bis zwei Tropfen entionisiertem Wasser auf einer Karteikarte. Nehmen Sie eine vorbereitete Kartenspitze am breiten Ende mit einer Pinzette auf und tupfen Sie die gebogene Spitze in die Leimwassermischung, um eine kleine Menge Kleber aufzutragen. Setze die gebogene Spitze der Kartenspitze auf die vordere Seite des rechten Bauches der Fliege um die Bauchsegmente zwei und drei an.

Bevor der Kleber trocknet, stellen Sie den Flügel so ein, dass seine vordere hintere Achse senkrecht zur gebogenen Spitze der Kartenspitze steht. Stecken Sie einen Befestigungsstift Nummer drei in das breite Ende der Kartenspitze und befestigen Sie ihn an einem Insektenstiftblock. Beschriften Sie jeden Pin oder jede Pin-Reihe mit dem entsprechenden Genotyp.

Um hochauflösende Fotos von punktförmig montierten Drosophila-Augen aufzunehmen, schalten Sie das Stacking-Imaging-System ein. Richten Sie dann ein DSLR-Kameragehäuse mit einem 70- bis 200-Millimeter-Teleobjektiv ein, das über einen 77-Millimeter-Objektivadapter an einem 20-fach-Apo-Mikroskopobjektiv befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Probe mit einem Blitz durch einen Diffusor beleuchtet wird.

Steuern Sie die Z-Positionierung der Kamera mit einem StackShot-Controller und einer Makroschiene. Positionieren Sie die punktgebundene Fliege mit dem Auge zum Objektiv hin auf dem universellen Tisch-Gimbal. Passen Sie die Kopfposition an und verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette, um eine optimale Ausrichtung zu gewährleisten.

Schließen Sie die Kamera an einen Laptop an und passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an. Stellen Sie die Vergrößerung auf 20x, die Verschlusszeit, 1/200 Sekunde, die Blende f/2.8 und ISO 400 ein. Legen Sie dann den Speicherort für den resultierenden Bildstapel im gewünschten Dateiordner fest.

Passen Sie nun die Einstellungen für den Fokusstapel an der StackShot-Steuereinheit im Auto-Distance-Modus an. Stellen Sie die Schrittweite auf fünf Mikrometer ein und berechnen Sie die Anzahl der Schritte, indem Sie die Start- und Stopppositionen des Fokusstapels festlegen. Betrachten Sie die Probe im Live-View-Modus, während sich die Kamera im Auto-Shoot-Modus befindet.

Bewegen Sie die Schiene so, dass der nächstgelegene Teil der Probe scharf ist. Gehen Sie dann zum am weitesten entfernten interessanten Merkmal und passen Sie den Fokus an. Versetzen Sie die Kamera wieder in den manuellen Aufnahmemodus und starten Sie die Bildaufnahme über die StackShot-Steuereinheit.

Öffnen Sie nach der Bildgebung die aufgenommenen Bilddateien in der referenzierten Focus-Stacking-Software. Wählen Sie Stapeln und dann Alles ausrichten und stapeln oder Pmax, um ein gestapeltes Bild zu generieren. Klicken Sie dann auf Datei und Ausgabebild speichern, um das endgültige gestapelte Bild als TIF-Datei zu speichern.

Nachdem Sie stecknadelmontierte Drosophila-Augen fotografiert haben, wählen Sie das gestapelte Bild für die Analyse aus, bei dem das Auge zentriert und ausgerichtet ist, mit angemessener Beleuchtung und minimaler peripherer Unschärfe. Öffnen Sie das Bild der 500-Mikrometer-Maßstabsleiste in der Fidschi-Software. Messen Sie die Länge der Maßstabsleiste mit dem Werkzeug für gerade Linien.

Klicken Sie auf Analysieren und messen, um den Pixelabstand aufzuzeichnen, der 500 Mikrometern entspricht. Berechnen Sie dann Pixel pro Mikrometer und verwenden Sie diese, um Pixelmessungen in Mikrometermessungen umzuwandeln. Öffnen Sie die gestapelte Bilddatei in Fidschi.

Wählen Sie die Lupe aus der Symbolleiste aus, um den Fokusbereich zu vergrößern. Füllen Sie den Bildschirm mit dem Auge und der umgebenden Nagelhaut des Kopfes. Wählen Sie dann in der Symbolleiste das Freihandauswahlwerkzeug aus und skizzieren Sie den Netzhautbereich, der der äußersten Reihe der Ommatidien folgt.

Um einen Teil der Auswahl zu entfernen, halten Sie die Optionstaste gedrückt und wählen Sie die Pixel aus, die Sie entfernen möchten. Um der Auswahl etwas hinzuzufügen, halten Sie die Wahltaste und die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie die Pixel aus, die Sie hinzufügen möchten. Um die Fläche zu berechnen, wählen Sie Analysieren und Messen aus.

In einem neuen Fenster werden die Parameter Fläche, Mittelwert, Minimum und Maximum angezeigt. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, um sie zu dokumentieren und von Pixel- in Mikrometermessungen umzuwandeln. Die Überexpression von DNhe2 in GMR-DNhe2-Fliegen führte zu signifikant kleineren Augen adulter Fliegen im Vergleich zu adulten Wildtyp-Fliegen.

GMR-DNhe2-Fliegen zeigten eine Verringerung der Augenpartie um 41 % im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen und eine 48-prozentige Reduktion im Vergleich zu GMRGAL4 heterozygoten Fliegen. Die Augengröße wurde in GMR-DNhe2 Fliegen, die heterozygot für Atg1 Allel 3 sind, von 74,28 Quadratmikrometern auf 129,9 Quadratmikrometer wiederhergestellt.