Organotypische Gewebemodellsysteme zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro

Biofilme für Zahnplatten bestehen aus Hunderten von Mikroorganismen, die Entzündungen in ihrem Mundepithel auslösen und zu Krankheiten wie Zahnfleischentzündungen führen können. Wir wollen diese Wechselwirkungen mit Hilfe von organotypischen Gewebemodellen besser verstehen. Diese Systeme bieten nützliche Plattformen, um alternative Behandlungsmodalitäten kontrolliert zu bewerten.

Die Weiterentwicklung der Sequenzierungstechnologien in den letzten Jahren verändert also das Gebiet der Infektionsbiologie. Diese Technologien ermöglichen es uns, die Interaktionen zwischen Wirtserregern und Wirten mit Hilfe mehrerer OMICs-Techniken durch die Bewertung von Wirts- und mikrobiellen Signaturen auf proteomischer, transkriptomischer und metabolomischer Ebene zu untersuchen. Unsere jüngste Forschung hat die Bedeutung von interimperialen und polymikrobiellen Wechselwirkungen bei Biofilminfektionen hervorgehoben.

Durch den Einsatz von In-vitro-Modellsystemen waren wir in der Lage, Biofilm-Interaktionen des Wirts zu untersuchen, neuartige Anti-Biofilm-Therapeutika zu testen und mikrobielle Gemeinschaften mit innovativen Technologien wie RAM und Spektroskopie zu profilieren. Zukünftige Studien, die diese organotypischen Gewebemodelle verwenden, zielen darauf ab, eine Multi-OMIC-Signatur und ein gemeinsames Profiling des Mikroorganismus sowie des Wirtsgewebes und der Kultur zu erreichen. Wir hoffen, komplexe Wechselwirkungen zwischen dem Wirt und bestimmten Bakterien und Pilzarten in unseren Biofilmmodellen aufzudecken und zu entwirren.

Entfernen Sie zunächst die gefrorenen Stiele von porösen Kügelchen, die Streptokokken-Spezies enthalten, bei 80 Grad Celsius. Wiederbelebung von Streptokokken-Spezies auf Columbia-Blutschnecken-Basisplatten, die 5 % steriles defibriniertes Pferdeblut enthalten. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Übertragen Sie am nächsten Tag drei bis vier Kolonien vom Teller auf 10 Milliliter Trypton-Sojabrühe-Medium. Kultivieren Sie die Brühe bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 16 bis 18 Stunden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen fünf Minuten lang bei 3.000 g bei 20 Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellpellets mit 10 Millilitern sterilem PBS. Suspendieren Sie die Pellets erneut in 10 Millilitern PBS und standardisieren Sie jede Suspension der Streptokokkenspezies einzeln mit einem auf 550 Nanometer eingestellten Spektralphotometer. Nach der Standardisierung verdünnen Sie jede Streptokokken-Suspension eins bis 10, um eine Konzentration von eins mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Todd Hewitt-Bouillon und Roswell Park Memorial Institute-Medium zu erreichen.

Pipettieren Sie 500 Mikroliter verdünnter Zellsuspensionen auf eine 24-Well-Mikrotiterplatte, die eine 13-Millimeter-Hydroxylapatit-Scheibe enthält. Inkubieren Sie die Kultur 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die Bildung von Biofilmen zu ermöglichen. In ähnlicher Weise wird eine Kultivierung für anaerobe Mikroorganismen auf einer anspruchsvollen anaeroben Schneckenbasis durchgeführt, die 5% steriles defibriertes Pferdeblut enthält.

Standardisieren Sie jeden anaeroben Mikroorganismus auf eine bestimmte Absorption und verdünnen Sie ihn in einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Todd Hewitt-Brühe und Medium des Roswell Park Memorial Institute. Entfernen Sie nach der Reifung des Streptokokken-Biofilms vorsichtig nicht anhaftende Zellen und verbrauchte Medien aus den Vertiefungen. Geben Sie 500 Mikroliter standardisierte eins mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter Suspensionen von vier anaeroben Mikroorganismen in jede Vertiefung.

Inkubieren Sie die Biofilme 24 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag nicht anhaftende Zellen und verbrauchte Medien aus den Vertiefungen. Fügen Sie 500 Mikroliter sterile Eins-zu-Eins-Mischung aus Todd Hewitt Brühe und Roswell Park Memorial Institute Medium hinzu.

Kulturieren Sie die Biofilme 24 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen. Waschen Sie die Biofilme am siebten Tag zweimal mit 500 Mikrolitern sterilem PBS für die Co-Kultur. Zu Beginn packen Sie das menschliche orale Epithel oder HOE-Gewebe und -Medium aus und überführen Sie es in eine Sicherheitswerkbank der Klasse zwei.

Geben Sie einen Milliliter des mit dem Tissue gelieferten Erhaltungsmediums in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette die Polycarbonat-Einsätze, die das HOE-Gewebe enthalten, von der Nährstoffschnecke und der 24-Well-Versandplatte. Übertragen Sie das Gewebe auf die vorbereitete 12-Well-Platte.

Inkubieren Sie die Gewebemodelle 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um sie an Laborbedingungen zu gewöhnen. Um die Biofilme von den Hydroxylapatit-Scheiben zu entfernen, heben Sie die Scheiben mit einer 19-Gauge-Nadel und einer Pinzette von der Unterseite der 24-Well-Platte an. Übertragen Sie die Discs in ein Bijou, das einen Milliliter steriles DPBS enthält.

Die Scheiben werden 10 Minuten lang bei 35 Kilohertz in einem Beschallungswasserbad beschallt. Entfernen Sie nach der Akklimatisierung mit einer Pinzette die Gewebeeinsätze von der 12-Well-Platte. Pipettieren Sie 100 Mikroliter des Biofilms direkt auf die Gewebemodelle.

Übertragen Sie die Einsätze auf eine weitere 12-Well-Platte mit einem Milliliter frischem Pflegemedium. Inkubieren Sie die Gewebemodelle 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie für die Gewebeverarbeitung 350 Mikroliter RLT-Lysepuffer vor, der 1%ige Mercaptoethanol in einem O-Ring-Röhrchen mit zwei Millilitern Schraubverschluss enthält.

Geben Sie etwa 100 Mikroliter 0,5 Millimeter säuregewaschene Glasperlen in das Röhrchen. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Einsätze, die das Gewebe enthalten, vom Medium und entsorgen Sie alle verbleibenden mikrobiellen Suspensionen aus dem Einsatz. Halten Sie den Einsatz auf Augenhöhe und schneiden Sie dann mit einer 19-Gauge-Nadel vorsichtig das Gewebe und die Membran von der Unterseite des Einsatzes ab.

Übertragen Sie das Gewebe und die Membran in den vorbereiteten RLT-Puffer. Homogenisieren Sie das Gewebe 30 Sekunden lang mit einem Tisch-Bead-Beader-Homogenisator. Extrahieren Sie RNA aus dem resultierenden Lysat gemäß den Anweisungen des Herstellers im RNA-Extraktionskit.

Sammeln Sie die restlichen verbrauchten Gewebemedien für proteomische Analysen mit Methoden mit niedrigem und hohem Durchsatz. Die Genexpression von inflammatorischen Biomarkern im HOE-Gewebe war nach Exposition mit Biofilm-Sonicat im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle signifikant hochreguliert. Die größten Faltungsänderungen wurden für CCL2, CXCL1 und CSF3 beobachtet.

Die IL8-mRNA-Expression in HOE-Gewebe war nach Stimulation mit Biofilm-Sonicat im Vergleich zu kontrolliertem Gewebe um das 8,67-fache erhöht. Die IL8-Proteinspiegel in den verbrauchten Medien wurden von 1,005 Nanogramm pro Milliliter im Kontrollgewebe auf 4,245 Nanogramm pro Milliliter in Biofilm-sonicat-stimuliertem Gewebe erhöht.