Name: Optimierung der in vitro Transkriptionsreaktion für die mRNA-Produktion mittels chromatographischem At-Line-Monitoring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle chromatographische Methode zur Optimierung der in vitro Transkription für mRNA-Produktion. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Monitoring von NTP-Verbrauch und mRNA-Ertrag bis zu 25 Gramm pro Liter.

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<ol><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).</li>
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<li>Baptista, B. R., Carapito, N., Pichon, C., Sousa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA%2C+a+revolution+in+Biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">mRNA, a revolution in Biomedicine.</a> Pharmaceutics. 13, 2090(2021).</li>
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<li>Rosa, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mRNA+vaccine+production+with+Bayesian+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (11), 3127-3139 (2022).</li>
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<li>Pregeljc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yield+of+in+vitro+transcription+reaction+with+at-line+high+pressure+liquid+chromatography+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).</li>
<li>Kern, J. A., Davis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fed-batch+system+to+produce+RNA+by+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription.</a> Biotechnol Prog. 15 (2), 174-184 (1999).</li>
<li>Skok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-Scale+mRNA+Production+Using+a+250-mL+Single-Use+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemie+Ingenieur+Technik%22%5BJournal%5D)">Gram-Scale mRNA Production Using a 250-mL Single-Use Bioreactor.</a> Chemie Ingenieur Technik. 94 (12), 1928-1935 (2022).</li>
<li>Welbourne, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+exchange+HPLC+monitoring+of+mRNA+in+vitro+transcription+reactions+to+support+mRNA+manufacturing+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development.</a> Front Mol Biosci. 11, 1250833(2024).</li>
<li>Lee, K. H., Song, J., Kim, S., Han, S. R., Lee, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+strategies+for+optimization+of+in+vitro+transcription+and+quality+control+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring strategies for optimization of in vitro transcription and quality control of RNA.</a> Front Mol Biosci. 10, 1229246(2023).</li>
<li>Matuszczyk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+provides+valuable+process+insights+for+cell-derived+and+cellular+products%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products.</a> Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).</li>
<li>Mu, X., Hur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of in vitro-transcribed RNA.</a> Acc Chem Res. 54 (21), 4012-4023 (2021).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+particle+as+an+RNA+adsorbent+for+facile+purification+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).</li>
<li>Ziegenhals, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dsRNA+by-products+during+in+vitro+transcription+can+be+reduced+by+using+low+steady-state+levels+of+UTP%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP.</a> Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).</li>
<li>Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+aptamer-based+real-time+monitoring+of+enzymatic+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis.</a> J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m PES-Membranfilter, z. B. Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Kunststoffröhrchen; z. B. DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Kunststoffröhrchen; z. B. DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>ATP Solution</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R1331T2</tr><tr><td>Tischkühler -20 > C</td><td>Brand</td><td>114935</td><td></td></tr><tr><td>CIMac PrimaS 0,1 mL Analysesäule (2 & Mikro; m)</td><td>Sartorius BIA Trennungen</td><td>110.5118-2, 2 &micro; m Kanäle</td><td></td></tr><tr><td>CTP Lösung</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R3331T2</tr><tr><td>DVB-T</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 x 2H2O</td><td>Kemika&nbsp;</td><td>z.B. 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>GTP Lösung</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R2331T2</tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Fläschchen mit hoher Rückgewinnung</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM 9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovolumen-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientic</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>mRNA Standard, mFix4, 4000 nt</td><td>Sartorius BIA Trennungen</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td>Merck 1064691000</td><td></td></tr><tr><td>PATfix mRNA-Analyseplattform&nbsp;</td><td>Sartorius BIA Trennungen</td><td>PAT0021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 100 &ndash; 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referenz 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 2 &ndash; 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referenz 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20 &ndash; 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referenz 2</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophosphatase</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away Dekontaminationsreagenz</td><td>Thermo Scientic</td><td>10328011</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Inhibitor</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>RNK3501</tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>T7 mRNA-Polymerase</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Thermo Scientic</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>UTP Lösung</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R5331T2</tr><tr><td>Fläschchenkappen</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierung der in vitro transkriptionsreaktion für die mrna-produktion mittels chromatographischem at-line-monitoring

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

Die in diesem Protokoll beschriebene chromatographische Analyse kann entweder zur IVT-Optimierung oder zur Umwandlung einer Batch-IVT-Reaktion in eine Fed-Batch-Reaktion verwendet werden (Abbildung 1).
Um die Wirkung verschiedener Pufferzusammensetzungen auf die Kinetik der IVT-Reaktion zu testen, wurden drei verschiedene IVT-Reaktionen gemäß dem in Tabelle 2 beschriebenen Protokoll gemischt. Tris-haltiger Puffer, bei dem der pH-Wert mit HCl eingestellt wurde, wurde mit Tris-Puffer verglichen, bei dem der pH-Wert mit Essigsäure eingestellt wurde. Des Weiteren wurden beide Tris-Puffer mit dem HEPES-Puffer verglichen, wobei der pH-Wert mit NaOH eingestellt wurde. Die Zusammensetzung aller 1x IVT-Puffer bestand aus 40 mM Tris/HEPES, 10 mM DTT, 2 mM Spermidin und pH 7,9.
Aus 100 μl IVT-Reaktionsmischung wurden 2 μl IVT-Probe aus der IVT-Reaktion entnommen und in der ersten Inkubationsstunde alle 15 Minuten und dann alle 30 Minuten bis 180 Minuten der Inkubation mit 2 μl 100 mM EDTA abgeschreckt. Die erwartete endgültige mRNA-Ausbeute für diese Reaktionsbedingung betrug 15 mg/ml, was bedeutet, dass auf die 2-fache Verdünnung durch Quenching eine 400-fache Verdünnung in MPA+NaCl für die Analyse folgte. Die Probe wurde insgesamt 800-fach verdünnt, was bedeutet, dass selbst bei einer Produktion von 15 mg/ml die auf die analytische chromatographische Säule geladene mRNA-Konzentration immer noch innerhalb der Konzentrationen der Kalibrierkurve lag.
NTP- und mRNA-Areale an A260 wurden für jede einzelne Probe zu jedem einzelnen Zeitpunkt (tx) integriert. Die Flächen wurden dann unter Verwendung der mRNA-Kalibrierungskurve und des prozentualen Verbrauchs für NTPs in Konzentrationen für mRNA umgerechnet, wobei die A260-Fläche von NTPs bei 0 min (t0) als 100 % verwendet wurde (siehe Gleichung unten).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;">
Die Ergebnisse können als Diagramme für jede einzelne IVT-Reaktion dargestellt werden, wobei die Zeit auf der x-Achse und die mRNA-Konzentration und die verbleibenden NTPs auf der y-Achse dargestellt sind (Abbildung 2A). Alle IVT, d. h. mRNA-Konzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit, können ebenfalls zusammen in einem Diagramm dargestellt werden, und die Kinetik der mRNA-Produktion kann untersucht und die optimalen IVT-Bedingungen ausgewählt werden (Abbildung 2B).
Für das Fed-Batch-Experiment wurde IVT wie in Tabelle 3 beschrieben gemischt. Von 300 μl IVT-Reaktionsgemisch wurden 2 μl IVT-Probe aus der IVT-Reaktion entnommen und alle 30 min mit 2 μl 100 mM EDTA abgeschreckt. Zusätzlich wurde die Probe unmittelbar nach jeder Zugabe von NTP+MgCl2 in großen Mengen entnommen. Eine Zuführlösung, die 42,4 mM jedes NTP und 152,5 mM MgCl2 enthielt, wurde im Voraus hergestellt, und 106 μl jedes einzelnen 200 mM NTP wurden mit 76,2 μl 1 M MgCl2 gemischt. Es wurde ein Fütterungsschema eingeführt, bei dem stündlich Bolusnahrung hinzugefügt wurde (bei 60 Minuten, 120 Minuten, 180 Minuten und 240 Minuten Inkubation). Das Fütterungsschema ist in Tabelle 3 beschrieben. Die Proben wurden nahezu in Echtzeit analysiert, wobei die Analytik wie für die IVT-Reaktion in großen Mengen beschrieben wurde. Nach 300 min Überwachung wurde die IVT-Reaktion abgeschreckt.
Die Ergebnisse können als verbleibende NTPs/mRNA-Produktion über die Zeit der Inkubation dargestellt werden. Da die Zugabe von Bolusfutter auch die IVT-Reaktion verdünnt, sinkt die mRNA-Konzentration in IVT bei jeder Futterzugabe (Abbildung 3A). Die Zunahme der mRNA-Masse kann auch anhand von Transkriptionsfaktoren (definiert alsmRNA/mpDNA) gemessen und dargestellt werden, was einen linearen Anstieg der mRNA-Produktion im Laufe der Zeit zeigt (Abbildung 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Übersicht (A) Darstellung des IVT-Optimierungsablaufs mit chromatographischer At-Line-Analyse, Quantifizierung von NTPs und mRNA. (B) Repräsentative Chromatogramme einer IVT-Batch-Reaktion, die zu (i) t0, (ii) Mittelpunkt und (iii) Endpunkt der Reaktion entnommen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Batch-IVT-Diagramme. (A) Repräsentatives Diagramm der IVT-Reaktion mit mRNA-Produktion und NTP-Verbrauch auf der y-Achse. mRNA-Konzentrationsplateau, sichtbar bei 120 - 180 min Inkubation, das mit dem NTP-Verbrauch korreliert, da limitierendes NTP (ATP) nach 120 min verbraucht wird. (B) IVT-Diagramm, das den Einfluss von IVT-Puffer auf die IVT-Kinetik zeigt. IVT, das Puffer A (Tris+Essigsäure) enthält, zeigte die schnellste mRNA-Produktion, gefolgt von Puffer B (Tris+HCl) und Puffer C (HEPES+NaOH) als langsamste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg"> 
Abbildung 3: IVT-Diagramm der Fed-Charge. (A) IVT-Diagramm, in dem NTP+MgCl2-Futter bei 60, 120, 180 und 240 min zugegeben wurden. Die mRNA-Konzentration in der IVT-Reaktion sinkt bei jeder Futterzugabe aufgrund der Verdünnung mit NTP+MgCl2-Futter . (B) Die durch den Transkriptionsfaktor gezeigte Zunahme der mRNA-Masse ist während der gesamten Reaktionsinkubation linear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Generisches IVT-Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Batch-IVT-Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: Fed-Batch-IVT-Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Optimierung der in vitro Transkriptionsreaktion für die mRNA-Produktion mittels chromatographischem At-Line-Monitoring

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